薄壳山核桃花粉离体萌发液体培养基及其测定花粉活力的应用，该培养基以蒸馏水为溶剂，内含蔗糖、H3BO3和Ca(NO3)2·4H2O。培养方法包括水合处理、培养温度及时间。该发明专利技术解决了薄壳山核桃花粉萌发率低、花粉管生长缓慢的技术问题，花粉萌发率可高达70%以上。通过本发明专利技术所述的培养基及培养方法提高了薄壳山核桃花粉萌发和生长，操作简便、成本低、周期短、萌发率高，在胡桃科植物生物学中具有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物花粉活力测定
，尤其涉及一种薄壳山核桃花粉离体萌发的液体培养基，以及利用该培养基测定薄壳山核桃花粉活力的方法。
技术介绍
薄壳山核桃(Caryaillinoinensis)为胡桃科(Julandaceae)山核桃属(Caryanutt)植物，又名美国山核桃、长山核桃。薄壳山核桃是世界著名的干果树种之一，其坚果个大、壳薄，出仁率高，取仁容易，产量高。薄壳山核桃亦是重要的木本油料植物，其油脂含量高达70%以上，不饱和脂肪酸含量高达97%，是上等的烹调用油。薄壳山核桃还是优良的材用和庭园绿化树种，其木材纹理细腻，质地坚韧，是建筑、军工、室内装饰和制作高档家具的理想材料；其树形高大、树势挺拔，是深受欢迎的观赏、遮荫和行道树种。薄壳山核桃原产于美国和墨西哥北部，现 以美国为中心产区，分布于美国、加拿大、墨西哥、巴西、阿根廷、秘鲁、意大利、法国、澳大利亚、埃及、南非、以色列、日本、中国等地。薄壳山核桃引种至中国已有100多年，至今未能形成产业化，开展良种选育是一项重要的工作。进行薄壳山核桃花粉活力测定的研究，对种质资源保存与创新、优良品种的选育具有理论和实践意义。薄壳山核桃为雌雄同株异花植物，大多品种雌雄异熟。因此在杂交育种过程中，需要对采集的花粉进行贮藏，贮藏后花粉的活力关系到人工授粉的成败。花粉活力测定的主要方法有染色法和离体萌发法。染色法是通过使用山色试剂对花粉粒进行染色，依据颜色变化判断花粉活力的高低，常用的染色试剂有I2-KI溶液和氯化三苯基四氮唑(TTC)等。目前已有对薄壳山核桃花粉进行TTC染色测定其活力的报道，但由于染色法只能反映花粉的代谢情况或营养物质含量，且颜色判断误差较大，并不能直接准确地表现花粉的活力。花粉离体萌发法提供的条件与花粉在柱头萌发的条件更为接近，是检测花粉活力最为可靠的方法。花粉离体萌发需要适宜的培养基及培养条件，常用的培养基组分为蔗糖、硼酸，温度20°C 25°C。薄壳山核桃花粉萌发困难，现有技术一直未能突破。在胡桃科植物中，仅见于对核桃(Juglans regia L.)花粉的花粉萌发进行了研究，但萌发率最高仅为2.22%，不能准确地反映花粉活力。
技术实现思路
解决的技术问题:提供一种薄壳山核桃花粉离体萌发液体培养基及其测定花粉活力的应用，在确定薄壳山核桃花粉离体萌发培养体系的基础上，对薄壳山核桃花粉离体培养，并能够可靠有效的测定薄壳山核桃花粉活力。技术方案:一种薄壳山核桃花粉离体萌发液体培养基，该培养基以蒸馏水为溶剂，内含蔗糖、H3BO3 和 Ca(NO3)2.4H20。所述溶质由200g/L 的蔗糖、20(T300mg/L 的 H3BO3 和 500mg/L 的 Ca(NO3)2.4Η20 组成。上述培养基测定花粉活力的应用，包括以下步骤:1)花粉采集选择发育正常、无病虫害的健壮薄壳山核桃植株，在花药变黄时采摘雄花花序，将其摊在硫酸纸上，置于避风干燥处，次日花药即可散粉；筛出花粉，装入密封袋中，冷藏备用；2)花粉复水处理在密闭的容器中，用K2SO4或CuSO4.5Η20饱和盐溶液调节相对湿度RH=97%，将花粉放置于该容器中，进行4 8h的复水处理；3)花粉离体萌发及花粉管生长同时配制液体培养基，其组分为:200g.Γ1的蔗糖+ 200 300mg.Γ1的H3BO3 +500mg -Γ1的Ca(NO3)2.4Η20 ;在凹槽载玻片上滴加50 μ L液体培养基，用大头针蘸取已复水处理的花粉使其均匀地撒在培养基上，将载玻片放入铺有湿润脱脂棉的培养皿内，在黑暗、25°C条件下保湿培养；4h后花粉开始萌发，花粉管伸长生长，24h后花粉生长趋于稳定；4)花粉活力的测定离体培养24h后，每个玻片随机选取5个不重复的视野，每个视野花粉数不少于50个，以花粉管长度大于花粉粒直径视为萌发，并选取50个测定花粉管长度，各试验均重复3次。有益效果:1、薄壳山核桃花粉在本专利技术提供的液体培养基上，25°C黑暗条件下培养，其花粉萌发率可达到74.46%，花粉管也能得到较好生长。2、利用该薄壳山核桃花粉离体萌发液体培养基与花粉管生长测定技术测定花粉活力测定结果稳定可靠，花粉萌发率反映有活力花粉所占比例，花粉管生长的观察与测量反映花粉粒生长状况的优劣，为薄壳山核桃花粉活力的测定提供了一种可靠有效的方法。附图说明图1为薄壳山核桃花粉离体培养不同时间的花粉萌发率和花粉管的统计图；其中，A:萌发的花粉；B:生长6h的花粉管；C:生长24h的花粉管。具体实施例方式以下结合附图和实施例对本专利技术做进一步的详细说明。按照本专利技术的技术方案，首先制备薄壳山核桃花粉离体萌发液体培养基，该培养基是以蒸馏水为溶剂，其中含有200g/L的蔗糖、20(T300mg/L的H3B03、500mg/L的Ca (NO3) 2.4H20。在确定薄壳山核桃花粉离体萌发培养体系的基础上，对薄壳山核桃花粉离体培养，并能够可靠有效的测定薄壳山核桃花粉活力。以下是专利技术人给出的实施例，该实施例是本专利技术较优的例子，主要用于进一步解释和理解本专利技术，本专利技术不限于该实施例。实施例1:1、薄壳山核桃花粉的采集选择发育正常、无病虫害的健壮薄壳山核桃植株，在花药变黄时及时采摘雄花花序，放入硫酸纸袋中迅速带回实验室，将其摊在硫酸纸上，置于避风干燥处，次日花药即可散粉。用120目药典筛筛出花粉，装入真空防水密封袋中，放在-20°C冰箱冷藏备用。2、花粉复水时间的筛选用K2SO4 或 CuSO4.5H20 饱和盐溶液调节 RH (Relative Humidity,相对湿度)，让花粉放在25 °C、RH=97%的密闭容器中复水，分别放置O、1、2、3、4、8、12、24h后，用BK培养基(含 10%wt 蔗糖、0.01%wtH3B03、0.03%wtCa(NO3)2.4Η20、0.02%wtMgS04.7Η20、0.01%wtKN03)测定不同复水时间花粉的萌发率。结果如表I所示，将花粉放入培养基前进行一定时间的复水处理是必要的。未做复水处理的花粉萌发率很低，仅为2.51%。通过复水处理后，花粉萌发率显著升高。复水4h后，萌发率达最高值51.78%，为对照的20.68倍。复水8h，萌发率与复水4h无显著差异。复水12h，萌发率降低。不同复水时间后，在相同培养基下，花粉管生长无显著差异。因此，薄壳山核桃花粉萌发的最佳复水时间为4 8h。表1:不同复水时间对薄壳山核桃花粉离体萌发的影响本文档来自技高网...
【技术保护点】
薄壳山核桃花粉离体萌发液体培养基，其特征在于：该培养基以蒸馏水为溶剂，内含蔗糖、H3BO3和Ca(NO3)2·4H2O。
【技术特征摘要】
1.壳山核桃花粉离体萌发液体培养基，其特征在于:该培养基以蒸馏水为溶剂，内含蔗糖、H3BO3 和 Ca(NO3)2.4H20。2.根据权利要求1所述的薄壳山核桃花粉离体萌发液体培养基，其特征在于所述溶质由 200g/L 的蔗糖、20(T300mg/L 的 H3BO3 和 500mg/L 的 Ca(NO3)2.4H20 组成。3.述任一权利要求所述培养基测定花粉活力的应用，其特征在于，包括以下步骤: 1)花粉采集 选择发育正常、无病虫害的健壮薄壳山核桃植株，在花药变黄时采摘雄花花序，将其摊在硫酸纸上，置于避风干燥处，次日花药即可散粉；筛出花粉，装入密封袋中，冷藏备用； 2)花粉复水处理 在密闭的容器中，用K2SO4或CuSO4.5H20饱和盐溶液调节...
【专利技术属性】
技术研发人员：张瑞，彭方仁，梁有旺，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：
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