本发明专利技术提供一种产生稳定浓度梯度的微流控芯片及细胞共培养方法，该微流控芯片由灌流通道、入口池、培养小室、废液池和微通道组成，本发明专利技术可在一块几平方厘米的芯片上进行细胞接触式共培养和混合式共培养，同时能够维持稳定的细胞趋化因子的浓度梯度，从而在体外构建肿瘤细胞的微环境，有效的模拟生物体内细胞与细胞因子，细胞与基质、细胞与细胞之间的相互作用，本发明专利技术具有操作简单、制作简单和样品用量少等特点，具有重要的生物医学研究价值和经济价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于将微流控芯片技术应用于生物医学研究领域，具体涉及。
技术介绍
细胞生物学研究正在 从对单种细胞的观察和研究，发展到对两种甚至多种细胞相互作用的观察和研究。对于复杂的生物学体系，多种细胞同时存在的体系才能更好的模拟真实存在的细胞微环境，从而更全面深入的探索细胞之间的复杂网络以及介导它们之间相互作用的信号通路等，对于研究机体发育、炎症反应、免疫反应，器官的功能以及肿瘤发生机制均有十分重要的意义。细胞共培养是目前研究细胞-细胞之间相互作用比较常用的方法。传统上研究细胞共培养方法一般分为三类:混合共培养、微载体共培养和bodyen小室共培养。混合共培养就是将两种及以上的细胞混合后在孔板内进行共培养，细胞共用培养液，通过分泌到培养液中的细胞因子进行细胞与细胞之间的相互作用，从而影响细胞的形态、增值或者其他行为；微载体共培养即将一种细胞培养在微载体上，另一种细胞培养在培养皿中，随后将徽载体细胞电加~培养皿中.过一定时间即可观察两种细胞相互作用，但这种方法一般应小于4小时，防止细胞从微载体迁移至培养皿中；bodyen小室共培养是一种底部由有机材料的微孔膜制成的培养套皿，因为可溶性物质可以自由通过，培养在套皿中的细胞可通过膜与培养在培养皿中的细胞发生相互作用。以上三种方法均存在试剂消耗量大，细胞用量多，不能方便的实现流体控制等诸多缺点。同时比较难以模拟生物体内复杂的微环境，对于实验结果难以实时追踪，只能获得最终结果，有可能缺失重要的生物学信息。而微流控芯片技术其特有的微尺寸特征与细胞大小正好匹配，通过对芯片功能的要求自行灵活设计，在一定程度上实现集成特征，非常适合进行细胞功能和细胞微环境相互作用的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，本专利技术具有操作简单、制作简单和样品用量少等特点。本专利技术提供了一种产生稳定浓度梯度的微流控芯片，该微流控芯片由灌流通道、入口池、培养小室、废液池和微通道组成；其中:灌流通道包括灌流通道A (I)、灌流通道B(2);入口池包括样品入口池A (3)、样品入口池B (4)、灌流通道A入口池(5)、灌流通道B入口池(6);废液池包括灌流通道A废液池(7)，灌流通道B废液池(8);培养小室包括培养小室A (9)和培养小室B (10);培养小室A和培养小室B左右相连形成一个细胞共培养单元；培养小室的上端与样品入口池相连，下端连接废液池，灌流通道与培养小室通过微通道相连。本专利技术提供的微流控芯片，所述微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上层材料为PDMS聚合物，下层材料为玻璃。本专利技术还提供了基于上述微流控芯片的细胞共培养方法，利用该芯片可以产生稳定的浓度梯度，进而进行细胞接触式共培养和/或细胞混合式共培养；具体步骤如下:(I)浓度梯度表征:用移液器取一定量的三维基质胶matrigel，通过样品入口池B和A顺序加入培养小室B和A，将其放入37°C培养箱孵育20-30min，待胶凝后，向灌流通道A和B分别加入含有异硫氰酸荧光素(FITC)标记的荧光染料的培养液和不含有荧光染料的培养液，并保证以0.4 μ Ι/min流速持续灌流；(2)细胞接触式共培养:通过样品入口池B将涎腺腺样囊性癌细胞(ACCM)和matrigel的混合物加入培养小室B，放置于CO2培养箱内；待胶凝20-30min后，通过样品入口池A将间充质干细胞(MSCs)加入培养小室A，放置于CO2培养箱内；待胶凝20-30min后，灌流通道A和B中加入细胞培养液，细胞培养液每天更换一次；(3)细胞混合式共培养:将涎腺腺样囊性癌细胞(ACCM)和间充质干细胞(MSCs)以10:1的比例混合在matrigel中，通过样品入口池B加入细胞混合物和matrigel,放置于CO2培养箱内，待胶凝20-30 min后,通过样品入口池A加入不含任何细胞的matrigel,待胶凝20-30 min后，形成胶与细胞的清晰界面，然后在灌流通道A和B分别加入含有细胞趋化因子的培养液和不含有细胞趋化因子的培养液。本专利技术提供的 细胞共培养方法，所述三维基质胶matrigel为小鼠癌组织中提取的基底膜样物质，低温(0_4°C)时为液态，室温时凝固成胶态；所述细胞趋化因子为基质细胞衍生因子CXCL12 ;所述浓度梯度表征中，细胞共培养单元横向的浓度梯度用异硫氰酸荧光素标记的右旋糖酐(FIEC-dextran,分子量为10000 Da)分子表征。总之，本专利技术可在一块几平方厘米的芯片上进行细胞接触式共培养和混合式共培养，同时能够维持稳定的细胞趋化因子的浓度梯度，从而在体外构建肿瘤细胞的微环境，有效的模拟生物体内细胞与细胞因子，细胞与基质、细胞与细胞之间的相互作用。本专利技术具有操作简单、制作简单和样品用量少等特点，具有重要的生物医学研究价值和经济价值。附图说明图1本专利技术微流控芯片整体结构示意图，其中:(1)灌流通道A，(2)灌流通道B，(3)样品入口池A，(4)样品入口池B，(5)灌流通道A入口池，(6)灌流通道B入口池，(7)灌流通道A废液池，(8)灌流通道B废液池，(9)培养小室A，( 10)培养小室B ； 图2显示相邻的两个培养小室在不同灌流时刻的实际拍摄荧光图片，其中:(a)0h;(b) 5h ; (c) 24h ； 图3相邻培养小室5 h时产生稳定荧光浓度梯度及荧光强度分布 图4相邻培养小室24 h时能够维持稳定荧光浓度梯度及荧光强度分布 图5芯片上细胞接触式共培养:两种细胞在不同的培养小室中，胶凝后，两侧灌流通道均加入细胞培养液； 图6芯片上细胞混合式共培养:一侧培养小室无细胞，一侧培养小室加入两种细胞混合物，形成细胞混合式共培养，两侧灌流通道分别加入含有细胞趋化因子的培养液和不含有细胞趋化因子的培养液； 图7芯片上接触式共培养涎腺腺样囊性癌细胞ACCM与间充质干细胞MSCs ； 图8间充质干细胞MSCs在涎腺腺样囊性癌细胞ACCM的诱导作用下发生的迁移距离随着共培养时间的变化柱状图；图9细胞趋化因子存在的条件下，涎腺腺样囊性癌细胞ACCM的定向迁移； 图10细胞趋化因子存在的条件下，间充质干细胞MSCs促进涎腺腺样囊性癌细胞ACCM的定向迁移。具体实施例方式下面的实 施例将对本专利技术予以进一步的说明，但并不因此而限制本专利技术。实施例1 所用微流控芯片为本实验室自行设计及制备。芯片由上下两层不可逆封接而成，上层材料为PDMS聚合物，下层材料为玻璃。如图1所示，灌流通道尺寸为长10 mm，宽500 μ m，高200-300 μ m (图中黑色区域)，培养小室A的尺寸为直径I mm，高120 μπι (图中灰色区域)，培养小室B的尺寸为直径I mm，高50 μπι (图中浅灰色区域)。用移液器取5μ I的三维基质胶Matrigel，通过样品入口池顺序加入培养小室B和Α，并将其放入37°C培养箱孵育20-30 min。待胶凝后，向灌流通道A和B分别加入含有FITC_dextran的培养液和不含有荧光染料的培养液，并保证以0.4 μ Ι/min的流速持续灌流。结果显不在O h时在相邻的两个培养小室中未发现有灭光物质存在,此时定乂为最初的起始点，随着灌流通道A和B中培养液的引入和持续灌流；在5 h时,在相邻的两个培养小室的横向方向上形成了 FIT本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种产生稳定浓度梯度的微流控芯片，其特征在于：该微流控芯片由灌流通道、入口池、培养小室、废液池和微通道组成；其中：灌流通道包括灌流通道A（1）、灌流通道B（2）；入口池包括样品入口池A（3）、样品入口池B（4）、灌流通道A入口池（5）、灌流通道B入口池（6）；废液池包括灌流通道A废液池（7），灌流通道B废液池（8）；培养小室包括培养小室A（9）和培养小室B（10）；培养小室A和培养小室B左右相连形成一个细胞共培养单元；培养小室的上端与样品入口池相连，灌流通道与培养小室通过微通道相连。
【技术特征摘要】
1.一种产生稳定浓度梯度的微流控芯片，其特征在于:该微流控芯片由灌流通道、入口池、培养小室、废液池和微通道组成； 其中:灌流通道包括灌流通道A (I)、灌流通道B (2)； 入口池包括样品入口池A (3)、样品入口池B (4)、灌流通道A入口池(5)、灌流通道B入口池(6)； 废液池包括灌流通道A废液池(7 )，灌流通道B废液池(8 ); 培养小室包括培养小室A (9)和培养小室B (10)； 培养小室A和培养小室B左右相连形成一个细胞共培养单元；培养小室的上端与样品入口池相连，灌流通道与培养小室通过微通道相连。2.按照权利要求1所述产生稳定浓度梯度的微流控芯片，其特征在于:所述微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上层材料为PDMS聚合物，下层材料为玻璃。3.关于权利要求1所述微流控芯片的细胞共培养方法，其特征在于:利用该芯片产生稳定的浓度梯度，进而进行细胞接触式共培养和/或细胞混合式共培养；具体步骤如下: (1)浓度梯度表征:用移液器取三维基质胶matrigel，通过样品入口池B和A顺序加入培养小室B和A，将其放入37°C培养箱孵育20-30min，待胶凝后，向灌流通道A和B分别加入含有异硫氰酸荧光素FITC标记的荧光染料的培养液和不含有荧光染料的培养液，并保证以一定的流速持续灌流； (2)细胞接触式共培养:通过样品入口池B将涎腺腺样囊性癌细胞(ACCM)和matrigel的混合物加入培养小室B，放...
【专利技术属性】
技术研发人员：秦建华，马慧朋，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：
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