一种提高肝片吸虫Cat?L1（FhCat?L1）DNA疫苗免疫保护率的方法，所述方法从提高其抗原在树突状细胞中的呈递作用入手，利用树突状细胞(DC)的表面分子的DEC-205的单链抗体scFvNLDC-145能靶向DC细胞的重要作用机理，提高Spragae-Dawley大鼠在免疫编码FhCat?L1的DNA疫苗后对肝片吸虫感染的抵抗力，从而提高FhCat?L1的DNA疫苗的免疫保护率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种提高抗肝片吸虫FhCat LI DNA疫苗免疫保护率的方法。具体涉及利用树突状细胞(DC)表面分子DEC-205的单链抗体SCFVNU)e_145靶向DC细胞，提高Spragae-Dawley大鼠在免疫编码FhCat LI基因的DNA疫苗后对肝片吸虫感染的抵抗力，从而提高抗肝片吸虫Cat LI DNA疫苗的免疫保护率。
技术介绍
肝片吸虫是一种寄生性蠕虫，能引起牛、羊等反刍动物及人的严重吸虫病[I]。在世界范围内，肝片吸虫病直接影响着畜牧业的发展和人类健康，据估计每年可造成约20亿美元的经济损失[2]，是一种不可忽视的重要人畜共患寄生虫病。对此病的防治一般采用三氯苯咪唑等化学药物，但这些药物只对早期的未成熟虫体或成虫具有良好效果，对感染后期的治疗不佳。最近发现，家畜已对三氯苯咪唑等化学药物产生耐药性[3-5]。同时，人们对畜产品中化学药物残留量的要求也越来越严格，这给利用化学药物控制吸虫病带来极大困难。因此，防治吸虫病急切需要一种能替代化学药物的治疗方法，这就给疫苗发展带来了良好契机[6]。事实上，到目前为止，有很多肝片吸虫的疫苗候选分子如谷胱甘肽S转移酶(GST)，亮氨酸氨肽酶(LAP)，脂肪酸结合蛋白(FABP)及组织蛋白酶L (Cat L)被用于开发诸如重组蛋白疫苗及DNA疫苗，虽然这些疫苗能在实验动物和大动物上产生一定的免疫保护[7，8]，但至今仍没有一种商品化疫苗能投入到临床生产，这在很大程度上受制于疫苗的保护率低下的现状，而这种现状与如何提高抗原的呈递有着密切的关系[9-12]。理想的疫苗应能够刺激机体产生特异性的免疫反应，并能诱导长期持久的免疫记忆以保护机体免受疾病侵袭。作为一种成 功的疫苗，其抗原可被抗原提呈细胞(antigen presentingcells，APC)所提呈，并激活机体免疫系统引起抗原特异性免疫反应。树突状细胞(DC)是已知体内最强的专职抗原提呈细胞，其最大的特点是能够刺激初始T细胞增殖和启动机体免疫反应。单链抗体是一种分子量小，穿透力强，可避免非特异性细胞毒性及免疫原性，目前被认为是最为理想的具有体内特异性导向作用的载体片段[13，14]。DEC205作为小鼠DC表面特异性标志，DEC205抗体NLDC-145具有特异靶向DC的作用，是体内DC修饰的理想载体。所以抗DEC205的单链抗体可将特定抗原定向呈递给DC，激活初始免疫细胞，使抗原提呈给T细胞，引起有效的抗原特异性免疫反应。组织蛋白酶L是一种半胱氨酸蛋白酶，通常情况下这种酶以非活性状态存在于分泌囊泡的肠上皮细胞中[15，16]，当前体酶活化并被释放后，寄生虫即可利用活化的组织蛋白酶行使多种重要的功能，如能在肝脏中将蛋白分解为多肽从而利于营养的吸收、降解基质蛋白从而有利于寄生虫从肠道迁移到肝脏[17，18]。研究还表明，组织蛋白酶L还在免疫逃避和免疫调节中发挥重要作用。它可分解宿主的免疫球蛋白从而破坏宿主的免疫攻击，并能介导和调节巨噬细胞的活性、抑制Thl免疫反应[19-21]。目前，对肝片吸虫组织蛋白酶L的疫苗开发主要集中在重组蛋白疫苗和DNA疫苗的研究上。有研究表明重组肝片吸虫组织蛋白酶L具有与天然蛋白相似的功能[22]，且在荷斯坦牛身上免疫后获得了 48.2%的减虫率和显著升高的总IgG [23]。在DNA疫苗的研究中，肝片吸虫Cat L DNA疫苗免疫大鼠能获得70%的免疫保护[24]。然而，要想开发出高效率的抗肝片吸虫的疫苗，这样的免疫保护率仍显不足。因此，如何提高疫苗的保护率就成了目前疫苗开发的热点。本专利技术正是着眼于提高肝片吸虫Cat LI DNA疫苗的免疫保护率，从提高其抗原在树突状细胞中的呈递作用入手，利用树突状细胞(DC)的表面分子DEC-205的单链抗体ScFvm45能靶向DC细胞的重要作用机理，提高Spragae-Dawley大鼠在免疫编码FhCat LI基因的DNA疫苗后对肝片吸虫感染的抵抗力，从而提高肝片吸虫Cat LI DNA疫苗的免疫保护率。
技术实现思路
针对肝片吸虫疫苗保护率和疫苗抗原呈递效率低下的现状，本专利技术主要着眼于提供一种利用DC特异性单链抗体提高肝片吸虫Cat LI (FhCat LI )DNA疫苗免疫保护率的新方法，用于指导抗肝片吸虫DNA疫苗的研发。本专利技术采取的技术方案是:一种提高肝片吸虫Cat LI (FhCat LI)免疫保护率的方法，所述方法包括以下步骤:1.运用反转录聚合酶链 式反应(RT-PCR)扩增目的基因，将扩增得到的Cat LI基因回收后连接入PMD18-T载体，得到pMD-Cat LI (SEQ ID N0.2)；2.利用大肠杆菌工程菌(Escherichia coli)和真核细胞Cos7表达目的蛋白；3.Cat LI多克隆抗体的制备；4.纯化和鉴定目的蛋白；5.设计合成单链抗体scF/.145的核苷酸序列(SEQ ID N0.1):用单链抗体片断ScFvm45序列，在其5’和3’分别加入CACC碱基和BamH I序列后进行全基因合成，合成片断命名为SF,同时合成SF的i sotype序列；6.构建并鉴定编码ScFVNU)G_145及目的蛋白的真核表达质粒:将pVAXl和合成的SF进行体外连接后转化大肠杆菌T0P10，然后提取质粒进行鉴定，测序正确的阳性重组质粒pVAXl- SF及步骤I中获得的pMD-Cat LI分别用BamH I酶切，回收到的目的片段以T4DNA连接酶连接过夜，连接产物转化到感受态细胞JM109中，提取质粒并进行测序鉴定后获得阳性 pVAXl-SF- Cat LI 重组质粒(SEQ ID N0.3)；7.动物免疫及感染试验；8.动物体液及细胞免疫评价；9.免疫保护率评价。本专利技术利用树突状细胞(DC)的表面分子的DEC-205的单链抗体scFv 45靶向DC细胞，提高Spragae-Dawley大鼠在免疫编码FhCat LI的DNA疫苗后对肝片吸虫感染的抵抗力，从而提高FhCat LI的DNA疫苗的免疫保护率，其优点在于:1、与非DC靶向DNA疫苗相比，所采用的DC特异性单链抗体能靶向DC细胞，可特异性提高抗原的呈递效率，从而提高免疫保护率(83.1%)。2、采用的骨架质粒pVAXl为真核表达质粒pcDNA3.1的升级构件，具有更多的技术优势。3、pVAXl-SF-Cat LI质粒免疫后获得的免疫保护率显著高于对照组，且获得了较pcDNA-Cat LI疫苗(36.3%)高的免疫保护率，也较别的学者以Cat LI为抗原研究的DNA疫苗保护率(70%)高。本专利技术技术具有针对性强、效率高、易于操作、效果明显等特点。该技术为肝片吸虫DNA疫苗的开发提供了一种新的方法，适宜在其他肝片吸虫候选疫苗分子上引申应用，对抗肝片吸虫疫苗的研发和生产及肝片吸虫病的免疫防控具有重要的指导意义和应用价值。附图说明图1是本专利技术所构建的疫苗质·粒及其结构。图2 是 pVAXl-SF- Cat LI 质粒及其 isotype 的结构。图中 scDEC 即 SF, targetprotein即Cat LI。DEC-H, DEC-L分别为SF的重链和轻链。图3是单链抗体ScFvnK45的核苷酸序列组成(SEQ ID N0.1)。加粗斜体分别本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种提高肝片吸虫Cat?L1（FhCat?L1）DNA疫苗免疫保护率的方法，所述方法包括以下步骤：1）运用反转录聚合酶链式反应RT?PCR扩增目的基因肝片吸虫Cat?L1，将扩增得到的Cat?L1基因回收后连接入pMD18?T载体，获得pMD?Cat?L1（SEQ?ID?NO.2）；2）利用大肠杆菌工程菌（Escherichia?coli）和真核细胞Cos7表达目的蛋白；3)?制备?Cat?L1多克隆抗体4)纯化和鉴定目的蛋白5)设计合成单链抗体scFvNLDC?145的核苷酸序列SEQ?ID?NO.1：用单链抗体片断scFvNLDC?145序列，在其5“和3“分别加入CACC碱基和BamH?I序列后进行全基因合成，合成片断命名为SF,?同时合成SF的isotype?序列；6)构建并鉴定编码scFvNLDC?145及目的蛋白的真核表达质粒：将pVAX1和合成的SF进行体外连接后转化大肠杆菌TOP10，然后提取质粒进行鉴定，测序正确的阳性重组质粒pVAX1??SF及步骤1中获得的pMD?Cat?L1分别用BamH?I酶切，回收到的目的片段以T4?DNA连接酶连接过夜，连接产物转化到感受态细胞JM109中，提取质粒并进行测序鉴定后获得pVAX1?SF??Cat?L1阳性质粒，pVAX1??SF?Cat?L1中SF?Cat?L1序列为SEQ?ID?NO.3；7)动物免疫及感染试验；?8)动物体液及细胞免疫评价；9)免疫保护率评价。...
【技术特征摘要】
1.一种提高肝片吸虫Cat LI (FhCat LI) DNA疫苗免疫保护率的方法，所述方法包括以下步骤: 1)运用反转录聚合酶链式反应RT-PCR扩增目的基因肝片吸虫CatLI，将扩增得到的Cat LI基因回收后连接入pMD18-T载体，获得pMD-Cat LI (SEQ ID N0.2)； 2)利用大肠杆菌工程菌(Escherichiacoli)和真核细胞Cos7表达目的蛋白； 3)制备CatLI多克隆抗体 4)纯化和鉴定目的蛋白 5)设计合成单链抗体ScFvm45的核苷酸序列SEQID N0.1:用单链抗体片断ScFvm45序列，在其5’和3’分别加入CACC碱基和BamH I序列后进行全基因合成，合成片断命名为...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗洪林，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：
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