本发明专利技术涉及一种检测有关辣椒辣度基因的试剂盒及其检测方法；具体含有如下引物：pun1A、pun1B、pun1C；pun12F、pun12R；pun13D、pun13E、pun13F；本发明专利技术使用特殊设计的引物，扩增提取到的辣椒基因组DNA中的Pun1、pun1突变、pun12突变和pun13突变的基因片段，能够实现其快速检测有关辣度相关基因，即通过上面的鉴定Pun1基因不同基因型的方法，就可以筛选出合适的亲本，预防辣椒的辣度随种植时间的推移而逐渐下降，避免品种退化及发展优良品种。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及准确检测有关辣椒辣度的基因，具体涉及一种检测有关辣椒辣度基因的试剂盒及其应用。
技术介绍
辣椒中辣味的主要成分是辣椒碱(capsaicin)。辣椒碱最早由Thresh在1876年从辣椒果实中分离出来并命名，如今在食品工业中作为添加剂和医药工业中作为抗菌、抗肿瘤和镇痛药物而被广泛使用。同时它还可用作防污漆添加剂、生物农药以及制造催泪弹和警用防卫武器等。其用途广泛，备受重视。此外，辣椒碱含量也是评估辣椒一类果实品质的指标之一。1.辣味基因的鉴定 辣椒碱(capsaicin),在分类学上看,只能在爺科辣椒属QCapsicum)植物的果实中，特别是其中的子房隔膜(placental dissepiment)中通过生物合成获得。早期的遗传学研究认为，辣椒辣味的产生是由单一显性基因C (Punl)控制的，在纯合隐性基因c (punl)作用下表现为辣味缺失，并且该基因对所有其他的辣味相关基因具有上位作用。Tanksley等最先找到了一个与C基因连锁的分子标记⑶35，但遗传距离大于10 CM。Ben等最先C基因位点定位于辣椒的第2号染色体上。后 来，Blum等以甜椒品种Maor {Capsicum annimm、与高辣辣椒BG2816 {Capsicum frutescens)为条本，构建了包含242个单株的F2群体,通过RFLP标记方法，遗传作图证实C基因位于第2号染色体上，并首次获得了与C基因紧密连锁的3个RFLP标记和I个离C基因位点仅0.4 CM的CAPS标记。随后，Blum等在前期构建的F2群体基础上，利用BSA法筛选到3个在不辣基因池与辣味基因池之间表现多态性的RAPD标记位点，通过成功转换成SCAR标记后，将其中的一个主效QTL位点cap定位于辣椒的第7号染色体上，实验证明该QTL位点可解释在不同生境条件下表型变异的34% 38%。Lee等在一年生辣椒annuum)中分离到一个与Cr基因共分离的辣椒素合成酶基因(Capsaicin Synthase，^，序列分析表明甜椒的G基因5’上游区域存在一段2529 bp碱基缺失。Ben-Chaim等以微辣辣椒品种NuMex RNaky (,Capsicum与高辣品种BG2814-6//YZie1Scefl1S)为亲本,构建了包含396个单株的F2群体及相应的F3群体，同时构建了包括SSR、AFLP、RFLP共728个标记的分子图谱，找到了 6个与辣椒素类物质含量相关的QTL位点，并分别定位于第3、4和7号染色体上。分析表明，辣椒素类物质含量表型变化主要贡献(24% 42%)来自于主效QTL位点cap7.1和定位于2号染色体无主效作用的标记(NP0326)间的二基因作用，而QTL位点cap7.2很可能是Blum等证实的对辣椒素类物质含量有显著影响的QTL位点cap。Stewart等在C cAifleflse辣椒中发现了一个Punl基因的等位基因位点，并命名为punl2。序列分析发现punl2位点存在4个碱基缺失，导致编码的蛋白质发生移码突变(frameshift)，最终导致辣椒辣味的散失。王岩等通过同源克隆法，从不同基因型辣椒中克隆了 C基因的全长，序列比对分析证实，甜椒C基因5’端约689 bp的碱基缺失可能是造成其辣味散失的原因。最近，Stellari等(2010)又在另一个辣椒种Capsicum frutescens中发现了新的等位基因位点punl3,实验证明punl3转录本的缺失与辣椒辣味的散失相关。Wyatt等在前人研究基础上发展了一套标记，用以区别不同辣椒种中Punl、punl、punl2和punl3基因型，这些标记的获得为辣椒种质资源的鉴定与辣椒育种提供了很好的参考。 2.Punl基因的不同突变类型 2.1 punl punl型突变会形成一个约2.5kb的片断缺失，导致Punl基因的启动子和大部分的外显子I (exonl)的缺失，最终阻止Punl基因转录和表达。见图4。 2.2 punl2· punl2型突变是移码突变，由位于exonl中的4个bp的碱基缺失造成，该突变基因可以被转录，但不会形成相应的蛋白产物。见图5。 2.3 punl3 punl3型突变会造成Punl基因3’端大段的基因缺失，该突变基因不会被表达转录。见图6。 3.保持辣椒辣度的原理 辣椒的辣度跟其中所含辣椒碱的量成正比。目前已知的影响辣椒果实中辣椒碱合成的基因只有Punl基因。因此一旦该基因产生突变，就会极大地影响辣椒碱的合成和积累，造成辣椒的辣度逐代下降。在辣椒基因组中含有两条Punl基因等位基因，根据孟德尔的等位基因分离规律，如果亲本的辣椒为野生型Punl/Punl纯合体，则子代的辣椒都为Punl/Punl基因型，其辣度会长时间的保持下去。如果亲本辣椒基因型为Punl/punl (或punl2、punl3)杂合子，则其子I代会形成Punl/Punl、Pun I/pun I和punl/punl这三种基因型，比例为1:2:1，子2代三种基因型的比例大致为1:3:1。可以看出，对保持辣椒辣度最为有利的Punl/Punl基因型纯合子的比例会逐代下降，从而导致辣椒的辣度逐渐下降。而如果亲本辣椒的基因型为punl/punl突变型纯合子，则后代基本不会有辣度。综上所述，如果需要长久保持辣椒的辣度，则需要其亲本都为野生型纯合子。因此对现有的辣椒对其中的PunUpunl突变、punl2突变和punl3突变的基因进行检测，能够实现其快速检测辣度，即通过上面的鉴定Punl基因不同基因型的方法，就可以筛选出合适的亲本，预防辣椒的辣度随种植时间的推移而逐渐下降。
技术实现思路
专利技术目的: 本专利技术提供一种试剂盒，该试剂盒可以快速和准确检测有关辣度的基因。技术方案 一种检测有关辣椒辣度基因的试剂盒，其特征在于含有如下引物:punl A:5’ ATTCTTGATCATCCTCATGCATC 3’punl B:5’ CACAAATTTTGTCCGATCTCAAC 3’punl C:5’ TTTGTTGCTTGTGCAACATCACC 3’punl2F:5’ AAGGTGGTAATTTGCTTGTAGTTC 3’punl2R:5’ CACCTTCAATCCCAAATTAATGTC 3’punl3 D:5’ TTGGGATTGAAGGTGGCAGAAG 3’punl3 E:5’ GAAGAAGGCATTCTTGGAGGG 3，punl3 F:5’ TCATGTCCATTCGGCCAAACAGTG 3’ 。所述的引物的浓度为10 μ Μ，各个引物体积为0.25 μ L 作为进一步说明:所述的一种检测辣椒辣度的试剂盒包括PCR缓冲溶液IOx PCRbuffer(100 mM Tris-HCl, pH 8.8,500 mM KCl,15 mM MgCl2,0.8% [v/v] Nonidet P40),2.5 μ L ；2.5 mM dNTPs, I μ L ；Taq polymerase 0.25 μ L ； , 10 μ L ;;引物(10 μ M):punl突变:punl A, punl B, punl C各0.25 μ L ;punl2突变:punl2 F, p本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测有关辣椒辣度基因的试剂盒，其特征在于含有如下引物：pun1?A：5“?ATTCTTGATCATCCTCATGCATC?3“???pun1?B：5“?CACAAATTTTGTCCGATCTCAAC?3“???????pun1?C：5“?TTTGTTGCTTGTGCAACATCACC?3“pun12?F：5“?AAGGTGGTAATTTGCTTGTAGTTC?3“pun12?R：5“?CACCTTCAATCCCAAATTAATGTC?3“????pun13?D：5“?TTGGGATTGAAGGTGGCAGAAG?3“?????pun13?E：5“?GAAGAAGGCATTCTTGGAGGG?3“pun13?F：5“?TCATGTCCATTCGGCCAAACAGTG?3“?。
【技术特征摘要】
1.一种检测有关辣椒辣度基因的试剂盒，其特征在于含有如下引物: punI A:5’ ATTCTTGATCATCCTCATGCATC 3’punI B:5’ CACAAATTTTGTCCGATCTCAAC 3’punI C:5’ TTTGTTGCTTGTGCAACATCACC 3’punI2 F:5’ AAGGTGGTAATTTGCTTGTAGTTC 3’punI2 R:5’ CACCTTCAATCCCAAATTAATGTC 3’punI3 D:5’ TTGGGATTGAAGGTGGCAGAAG 3’punI3 E:5’ GAAGAAGGCATTCTTGGAGGG 3，punI3 F:5’ TCATGTCCATTCGGCCAAACAGTG 3’ 。2.根据权利要求1所述的一种检测有关辣椒辣度基因的试剂盒，其特征包括PCR缓冲液 IOx PCR buffer 2.5 μ L, 2.5 mM dNTPs, I μ L ;聚合酶 Taq polymerase 0.25 μ L, 20ng/yL 基因组 DNA，引物为 10 μ MjpH2O 至 25 yL； 其中 IOx PCR buffer 为含有 100 mM Tris-HCl, pH 8.8,500 mM KCl，15 mM MgCl2,0.8% v/v Nonidet P40 的混合物；引物:punl A, pun I B, pun I C 各 0.25 μ L ；punl2 F, punl2 R 各 0.25 μ L ；punl3 D, punl3 Ε, punl3 F 各...
【专利技术属性】
技术研发人员：李永忠，滕凌，张娟，路易斯伊格纳罗，叶亚东，朱文华，王润华，全利，潘鹂，胡娟，肖慧，叶汝章，杨紫俊，张俊，霍世元，
申请(专利权)人：常州亚当生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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