本发明专利技术公开了一种检测结直肠癌血清miR-128的专用引物，包括miR-128的逆转录引物和检测引物、U6的逆转录引物和检测引物、miRNA-16的逆转录引物和检测引物，如SEQ?IDNO：1～9所示。一种检测结直肠癌血清miR-128的专用试剂盒，包括上述引物，以及RNA分离液。一种检测结直肠癌血清miR-128表达量的方法，步骤如下：（1）将待检测的血清标本与等体积RNA分离液混合，16000g离心10分钟，分离上清液；（2）RT-PCR扩增；（3）制作标准曲线（4）计算：得出基因的校正起始拷贝数Q；将miR-128的Q值与内参基因U6、miR-16的Q值的几何平均数相比，得到miR-128的相对表达量。本发明专利技术的检测方法，为结直肠癌的早期发现、早期治疗提供了重要的参考依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测结直肠癌血清miRNA-128的专用引物、试剂盒，以及检测结直肠癌血清miRNA-128表达量的方法，属于分子生物学检测
技术介绍
结直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，随着人民生活方式和膳食结构的改变，结直肠癌的发病率和死亡率呈逐年上升的趋势。结直肠癌在早期阶段相对容易治愈，而到晚期阶段往往预后较差。据统计，无侵袭转移的结直肠患者的5年生存率可高达90%，有局部转移者的5年生存率有68%，而带有远处转移者的5年生存率则仅有11%。因此早期发现是改善结直肠癌预后的关键。CT和MRI等对于小于Icm的病灶无法早期诊断，不能用于结直肠癌的早期筛查和诊断。电子肠镜检查虽可早期诊断结直肠癌，但却是有创检查，一定程度上增加了病人的痛苦。肿瘤标志物以其简便、经济、非侵入性等特点日益受到关注。但是，目前临床上推荐用于结直肠癌诊断和预后判断的肿瘤标志物只有CEA，而CEA作为肿瘤标志物其特异性以及在结直肠癌诊断方面的应用也备受质疑。因此目前的结直肠癌肿瘤标志物远远不能满足临床需求，寻找理想的用于早期诊断结直肠癌肿瘤标志物具有重要的临床意义。miRNAs是一类分布广泛的小的非编码蛋白质的单链小分子RNAs,其通过对mRNA降解或抑制其翻译，从而在转录后对靶标基因的表达水平进行调节，参与细胞分化、生长、凋亡、代谢等功能。近年来，肿瘤相关miRNAs陆续在肿瘤患者的血清中被发现，为肿瘤的无创性早期诊断提供了一条新的途径。作为潜在的生物标志物，miRNAs具有蛋白标志物无法比拟的优势。miRNAs稳定性非常好，有研究显示体液样本中的miRNAs的稳定性源于其在血液中以核酸-蛋白复合物形式存在或包被于外排颗粒当中，使miRNAs耐受包括核糖核酸酶、反复冻融、PH变化、长期保存等情况，不易被降解。miR-128最早作为一种抑癌基因在神经母细胞瘤中被发现，其有12 8-1和128-2两种前体形式，基因分别定位在第2和3染色体。Zhu等研究发现，miR-128通过靶向癌基因Bm1-1和ABCC5导致对化疗的耐受，并且miR-128在乳腺癌组织中的表达与患者的预后呈明显负相关。最新研究发现，miR-128的上调表达可以抑制肿瘤细胞的生长、增殖、凋亡、迁移和血管生成等，与人类多种肿瘤的发生、发展相关，提示对miR-128的表达检测可以成为肿瘤检测的指标之一。血清miRNAs主要的检测方法有克隆测序、RNA印迹杂交、基因芯片、逆转录-聚合酶链反应，其中基于SYBR Green的逆转录-实时荧光定量PCR方法是分析血清中miRNAs最常用的方法，其具有操作简便、敏感性高、重复性好，目前已在核苷酸检测领域得到广泛应用。采用该方法通常情况下需先对血清样本中的miRNAs进行分离提取，然后再对分离得到的miRNAs进行逆转录、PCR扩增检测，但目前关于miRNAs的提取步骤繁琐、试剂昂贵，并且在提取过程中不可避免的造成miRNAs分子的丢失，给实验造成了误差。因此，如果建立一种对血清中miRNAs直接进行检测的方法，无疑会给研究带来方便。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术提供了一种快速、简便、准确的检测结直肠癌血清miRNA-128的专用引物、试剂盒，以及检测结直肠癌血清miRNA-128表达量的方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的:一种检测结直肠癌血清miR-128的专用引物，包括:(I) miR-128的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ ID NO:1所示，检测引物的序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示:miR-128-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAGAG-3’ ；miR-128-F:5， -GGCTCACAGTGAACCGGT-3，；miR-128-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3J ；(2)U6的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ ID NO:4所示，检测引物的序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示:U6-RT:5’ -GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATAC-3’ ；U6-F:5’ -GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATAC-3’ ；U6-R:5， -AAATATGGAACGCTTCACGAATT-3，； (3)miRNA-16的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ ID N0:7所示，检测引物的序列如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示:miRNA-16-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3’ ；miRNA-16-F:5，-CGCCTAGCAGCACGTAAATA-3，；miRNA-16-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。所述引物的序列是根据microRNA数据库(http://www.mirbase.0rg/)上报的核苷酸序列 miR-128 (MIMAT0000424),miRNA-16 (MIMAT0000069)以及 GeneBank 数据库中的U6序列(X07425.1)为模板自主设计的。一种检测结直肠癌血清miR-128的专用试剂盒，包括上述引物，以及RNA分离液；所述RNA分离液由吐温20、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、牛血清白蛋白和水组成，其中，浓度如下:吐温20:2.5% (体积百分数)；三羟甲基氨基甲烷:50mmol/L ;乙二胺四乙酸:lmmol/L ;牛血清白蛋白:1% (质量百分数)。所述检测结直肠癌血清miR-128的专用试剂盒还包括PCR反应液，PCR反应液由IXSyber Green I荧光染料、DNA聚合酶、dNTPs、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁和水组成，优选的，各物质的浓度如下:DNA聚合酶:100U/ml，dNTPs:0.2mM ;氯化镁:6mM ；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐:16.5mM ;氯化钾:89.3mM。上述检测结直肠癌血清miR-128的专用引物、检测结直肠癌血清miR-128的专用试剂盒在定性检测血清miR-128或定量检测血清miR-128表达量中的应用。一种检测结直肠癌血清miR-128表达量的方法，步骤如下:(I)将待检测的血清标本与等体积RNA分离液混合，16000g离心10分钟，分离上清液；(2) RT-PCR扩增:向上述分离的上清液中加入SEQ ID NO:1所示的miR-128的逆转录引物，进行反转录得cDNA，取cDNA为模板，加入SEQ ID NO:2、3所示的引物以及PCR反应液，进行PCR扩增，检测样本阈值Cq (test sample);同时，从人结直肠癌细胞株HT29细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心)中提取miRNAs，逆转录成cDNA, 10倍梯度稀释，作为校对样本，在每个PCR反应板中进行检测，记录Cq值；内参基因U6、miR-16的RT-PCR扩增，除引物采用相对应的逆转录引物和检测引物外，方法相同；(3)制作标准曲线:上述检测完成后，拷贝数以10为底取对数作为横坐标，Cq值为本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测结直肠癌血清miR?128的专用引物，其特征在于：包括：（1）miR?128的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ?ID?NO：1所示，检测引物的序列如SEQ?ID?NO：2、SEQ?ID?NO：3所示：miR?128?RT：5’?GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAGAG?3’；miR?128?F：5’?GGCTCACAGTGAACCGGT?3’；miR?128?R：5’?GTGCAGGGTCCGAGGT?3’；（2）U6的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ?ID?NO：4所示，检测引物的序列如SEQ?ID?NO：5、SEQ?ID?NO：6所示：U6?RT：GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATAC；U6?F：GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATAC；U6?R：AAATATGGAACGCTTCACGAATT；（3）miRNA?16的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ?ID?NO：7所示，检测引物的序列如SEQ?ID?NO：8、SEQ?ID?NO：9所示：miRNA?16?RT：5’?GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA?3’；miRNA?16?F：5’?CGCCTAGCAGCACGTAAATA?3’；miRNA?16?R：5’?GTGCAGGGTCCGAGGT?3’。...
【技术特征摘要】
1.一种检测结直肠癌血清miR-128的专用引物，其特征在于:包括: (1)miR-128的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQID NO:1所示，检测引物的序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示:miR-128-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAGAG-3’ ；miR-128-F:5，-GGCTCACAGTGAACCGGT-3，；miR-128-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ ； (2)U6的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQID NO:4所示，检测引物的序列如 SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6 所示:U6-RT:GTGCTCGCTT CGGCAGCACATATAC ；U6-F:GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATAC ；U6-R:AAATATGGAACGCTTCACGAATT ； (3)miRNA-16的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQID NO:7所示，检测引物的序列如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示:miRNA-16-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3’ ；miRNA-16-F:5’ -CGCCTAGCAGCACGTAAATA-3’ ；miRNA-16-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。2.一种检测结直肠癌血清miR-128的专用试剂盒，其特征在于:包括权利要求1所述的检测结直肠癌血清miR-128的专用引物，以及RNA分离液；所述RNA分离液由吐温20、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、牛血清白蛋白和水组成，其中，浓度如下:吐温20:2.5%；三轻甲基氨基甲烧:50mmol/L ;乙二胺四乙酸:lmmol/L ;牛血清白蛋白:1%。3.根据权利要求2所述的检测结直肠癌血清miR-128的专用试剂盒，其特征在于:所述检测结直肠癌血清miR-128的专用试剂盒还包括PCR...
【专利技术属性】
技术研发人员：王传新，张欣，王海燕，
申请(专利权)人：山东大学齐鲁医院，
类型：发明
国别省市：
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