本发明专利技术公开了一种肌肉组织特异性表达Follistatin以提高牛瘦肉率的转基因载体，所述转基因载体含有小鼠的肌酸激酶(muscle?creatine?kinase，MCK)增强子、2.7kb牛的α-骨骼肌肌动蛋白基因的启动子、牛的Follistatin的cDNA和牛生长激素基因的3’端不翻译区域，且带有哺乳动物细胞中筛选用的抗性基因-嘌呤霉素基因和原核细胞中筛选用的抗性基因-博莱霉素基因。本发明专利技术的转基因载体可应用于体细胞克隆，以构建高瘦肉率的Follistatinmus转基因牛。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种肌肉组织特异性表达Follistatin以提高牛瘦肉率的转基因载体。
技术介绍
牛肉作为中国人民的主要肉类食品之一，保证全国人民有充足的、优质的牛肉供应是关系到人民日常生活的重要事件。而随着人口的增长和人民生活水平的提高，除了对牛肉的需求量增加以外，对牛肉的质量和口感的要求也提高了。因此,有必要建立和改良中国自己的牛的品种，改善牛肉口感和质量，以满足人民群众的生活需求。Follistatin是由肌肉细胞分泌到血液中的一种糖蛋白，它可与抑制肌肉生长的Myostatin结合,从而拮抗Myostatin的功能,进而促进肌肉的生长。已在小鼠和猴中通过实验证明，将表达Follistatin的腺病毒群(Adeno-associated Virus)注射到肌肉中，可有效地促进肌肉的生长，不仅提高了肌肉的重量，还增强了肌肉的力量(Haidet A.M.etal. Long-term enhancement of skeletal muscle mass and strength by single geneadministration of myostatin inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA,2008.105:4318-4322 ；Kota, J.et al.“Follistatin gene delivery enhances muscle growth andstrength in nonhuman primates”.Sci Transl Med, 2009.1,6ral5)。基于这些数据，我们预期在牛的骨骼肌中过表达Follistatin可提高牛的瘦肉率,并可改善肌肉的品质。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是一种能在肌肉组织特异性表达Follistatin以提高牛瘦肉率的转基因载体。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下:一种能在肌肉组织特异性表达Follistatin以提高牛瘦肉率的转基因载体包含小鼠的肌酸激酶(muscle creatine kinase,MCK)增强子、2.7kb牛的α-骨骼肌肌动蛋白(a -skeletal actin)基因的启动子、牛的Follistatin的cDNA和牛生长激素基因(bGH)的3’端不翻译区域，且带有哺乳动物细胞中筛选用的抗性基因-嘌呤霉素(PuiOmycin)基因和原核细胞中筛选用的抗性基因-博莱霉素(Zeocin)基因(见图2)。2.7kb的α-骨骼肌肌动蛋白(a-skeletal actin)的启动子可保证下游的基因在骨骼肌中特异表达，而且MCK增强子也具有肌肉组织特异性的增强子活性，可特异地促进下游基因的高表达。在此转基因载体中表达的是牛自身的Follistatin基因，所以从食品安全的角度讲，对消费者的健康没有任何影响。此外，本专利技术在嘌呤霉素和博莱霉素抗性基因的两端还加入LoxP序列，这样，在Follistatin基因整合到基因组DNA后，如有需要，本专利技术可通过表达Cre蛋 白，诱导LoxP序列的重组，以除去抗性基因，进一步保障转基因动物的食品安全性。本专利技术构建的肌肉组织特异表达牛Follistatin的转基因载体pHJ20的全序列如SEQ ID No:1所示，其中第5-1039碱基为牛Follistatin编码区，第1059-1272碱基为bGH 3’端不翻译区，第1448-1481碱基为LoxP，第1837-2508碱基为嘌呤霉素抗性基因，第2566-2937碱基博莱霉素(Zeocin)抗性基因，第2952_2985LoxP碱基为4458-4804 MCK增强子，第5110-7857碱基为牛α -骨骼肌肌动蛋白基因的启动子。本专利技术的转基因载体可应用于体细胞克隆，以构建高瘦肉率的Follistatin.转基因牛。附图说明图1是本专利技术的技术流程图。图2是本专利技术构建的PHJ20转基因载体的示意图。具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。实施例1:插入 LoxP-Puro-Zeo-LoxP 片段,构建 pZTl。将pO)NA3.I (myc-His) a 载体(Invitrogen)用 PvuII 酶切，酶切体系为 2 μ g 质粒DNA, 3 μ I 10 Xbuffer, 2 μ I PvuII 酶，加入 ddH20 补足体积至 30 μ 1，37°C温浴 3 小时。然后将酶切体系在I %的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出3.3kb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步 骤为，将紫外光下切下目的DNA条带装入1.5ml离心管中，称重后加入3倍体积的溶胶液，55°C保温10分钟，使琼脂糖凝胶完全融化；融化的凝胶待温度降至室温后，将混合液转入附柱中，10，OOOg离心I分钟，倒掉流出液；加入650 μ I漂洗缓冲液，10，OOOg离心I分钟，倒掉流出液；吸附柱再次离心，10，OOOg离心，I分钟，倒掉流出液；将吸附柱转移到一个新的1.5ml离心管中，加入50 μ I ddH20，放置I分钟，10，OOOg离心I分钟收集纯化产物。从pSNAP载体用EcoRV酶切出LoxP-Puro-Zeo-LoxP片段,酶切体系为3 μ g质粒DNA, 3 μ I 10 Xbuffer, 2 μ I EcoRV 酶，加入 ddH20 补足体积至 30 μ 1，37°C温浴 3 小时。然后将酶切体系在I %的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出1.7kb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。将pCDNA3.1 (myc-His) a(PvuII)和 LoxP-Puro-Zeo-LoxP (EcoRV)连接，连接反应中加入2μ I载体，6μ I插入片段，1μ I 10Xbuffer，I μ I T4DNA连接酶，16°C温浴16小时。将连接产物转化到E.coli的感受态细胞中。取一管50 μ I的Trans5 α感受态细胞置于冰上，待其融化后，向其中加入4μ I上述连接产物，轻弹混匀，后于冰上孵育30分钟；42°C热击30秒，后冰上静置10分钟；加入500 μ I无抗性的LB液体培养基，37°C震荡培养I小时；4，OOOrpm离心5分钟，吸走，保留100 μ I左右的培养基，用移液器将细菌沉淀吹打均勻后涂布在含氨节和博莱双抗性的LB培养基平板上。然后将平板置于37°C温箱培养16小时。克隆生长出来后，挑单克隆菌落至3ml含氨苄青霉素的LB培养液中，37°C震荡培养12小时，提取质粒DNA，用EcoRI酶切鉴定，阳性克隆中可得到2.9kb和2.0kb的两条DNA条带。再通过测序进一步确定阳性克隆的正确性，得到的克隆即为PZT1。实施例2:插入牛α-骨骼肌肌动蛋白基因的启动子DNA片段，构建pZT2。将pZTl用PvuI和NdeI双酶切，酶切体系为2yg质粒DNA，3y I 10Xbuffer,1.5μ I PvuI酶，1.5μ I NdeI酶，加入ddH20补足体积至30μ 1，37°C温浴3小时。然后将酶切体系在I %的本文档来自技高网...
【技术保护点】
肌肉组织特异性表达Follistatin以提高牛瘦肉率的转基因载体，其特征在于，所述转基因载体含有小鼠的肌酸激酶增强子、2.7kb牛的α?骨骼肌肌动蛋白基因的启动子、牛的Follistatin的cDNA和牛生长激素基因的3’端不翻译区域，且带有哺乳动物细胞中筛选用的抗性基因?嘌呤霉素基因和原核细胞中筛选用的抗性基因?博莱霉素基因。
【技术特征摘要】
1.肌肉组织特异性表达FolliStatin以提高牛瘦肉率的转基因载体，其特征在于，所述转基因载体含有小鼠的肌酸激酶增强子、2.7kb牛的α -骨骼肌肌动蛋白基因的启动子...
【专利技术属性】
技术研发人员：戴一凡，陈凌懿，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。