一株肿瘤靶向细菌及其菌剂制备方法与代谢产物，该肿瘤靶向细菌是昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01，XenorhabdusstockiaeHN_xs01；该菌种于2012年03月09日在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏编号为CCTCCNO：M2012069。本发明专利技术还包括该肿瘤靶向细菌的菌剂制备方法与代谢产物。本发明专利技术之肿瘤靶向细菌通过静脉注射后能特异积聚于小鼠肿瘤部位，而在小鼠的肝、肾、脾等正常组织和器官不能定殖，具有极强的肿瘤靶向性，通过最终肿瘤的重量比较，得到抑瘤率为60~100%，对小鼠黑色素瘤表现出很好的体内抗肿瘤效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一株肿瘤靶向细菌及其菌剂制备方法与代谢产物，尤其是涉及一株肿瘤靶向细菌昆虫病原线虫共生致病杆菌及其菌剂制备方法与代谢产物。
技术介绍
癌症已成为当今世界人类的主要杀手。传统治疗癌症的方法如放射疗法、化学疗法以及外科手术切除法，对一半的癌症患者没有效果。随着医疗技术的进步，光能疗法、人类α -乳清蛋白疗法(HAMLET)、高温疗法、射频疗法、饮食疗法、胰岛素增强疗法、基因治疗、端粒酶治疗、二氯乙酸(DCA)治疗和细菌治疗等方法被用于癌症的治疗，但这些新的方法都有各自的弊端，无法大规模用于临床治疗。靶向抗肿瘤是指在特定的导向机制作用下，将具有抗肿瘤活性的物质输送到肿瘤部位，但在机体其他组织或器官中不存在或存在很少，从而起到特异性杀伤肿瘤的效果，其具有用药量少、专一性强、毒副作用低、作用时间长等特点。近年来，细菌靶向治疗肿瘤成为一大研究热点。肿瘤内部存在低氧区 ，是传统的肿瘤治疗如放疗、化疗等方法效果不佳的主要原因，但部分厌氧或兼性厌氧细菌能在此微环境中繁殖生长，通过竞争有限的营养、分泌细胞毒素来消除肿瘤，而不会扩散到机体其他部位。另外，细菌具有能动性、抗生素敏感性及载运和表达多种抗肿瘤药物的能力，突显了其在临床应用中的潜力。细菌靶向治疗肿瘤在经过长时间且广泛的研究后，先后挖掘出梭状芽孢杆菌sp.)、鼠伤寒沙门氏菌(51 CAoJeraei1Swi1S )、双歧杆菌 iB.大肠杆菌 iE.coli )、霍乱弧菌(Kcholerae )、单核细胞增多性李斯特细菌iL.monocytogenes )等细菌用于祀向肿瘤治疗，但这些细菌作用方式单一且存有各种不足，如具有较强毒力的菌株在杀死肿瘤细胞的同时也对机体产生较强的毒性，而毒性较弱的菌株虽然有很高的肿瘤靶向性且对机体毒力较弱，但对肿瘤抑制效果较弱；对于坏死区域较小的早期肿瘤及外围含氧量较高的肿瘤，不适合厌氧菌的生长，兼性厌氧菌虽能弥补这一缺点，但肿瘤靶向性不强。昆虫病原线虫共生菌是 一类与线虫互惠共生的革兰氏阴性细菌，属肠杆菌科，存在于线虫肠道内，分为致病杆菌属(ifeflorAaAofesp.)和发光杆菌属(/jAoioraAAofesp.),分别与斯氏线虫(Sieifleraeaa)和异小杆线虫(ZfeterorAaMZii1S)共生，已有的研究表明该类细菌具有广谱高效杀虫、抑菌及体外抗肿瘤等生物活性，但有关该类细菌的体内抗肿瘤效果和肿瘤靶向性研究国内外尚无报道。虽然有关细菌靶向治疗肿瘤的研究起始较早，但在已经研究过的细菌中，具有较好抗肿瘤效果和较强肿瘤靶向性且对机体毒性较小的野生型菌株存在极少。厌氧细菌虽能特异积聚于肿瘤的无氧区，但在较大肿瘤的外围区域或早期肿瘤内，受到氧气影响而无法生存，对肿瘤的消除不彻底；兼性厌氧细菌虽能存在于肿瘤的有氧区域，但肿瘤靶向性不强，同时也能分布于机体的其他组织或器官中。高毒力菌株虽能对肿瘤具有较强的杀伤作用，但其同时也对机体有较大的毒副作用；低毒力菌株虽对机体毒副作用较低，但其抗肿瘤效果不强。昆虫病原线虫共生菌是一类与线虫互惠共生的革兰氏阴性细菌，存在于线虫肠道内，属肠杆菌科(Enterobacteriaceae),人们对该类细菌的研究起步相对较晚,主要集中于杀虫和抑菌两个方面，而在抗肿瘤方面的研究极少，只是初步尝试了个别菌株的体外抗肿瘤细胞活性。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一株肿瘤靶向细菌及其菌剂制备方法与代谢产物，该菌株具有极强的肿瘤靶向性，并且其菌剂与代谢产物具有较好的体内抗肿瘤效果。本专利技术解决所述技术问题采用的技术方案是: 一株肿瘤祀向细菌，是昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01 {Xenorhabdus stockiaeHN_xs01);该菌种于2012年03月09日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址:中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO:M 2012069。本专利技术之肿瘤革巴向细菌一昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01 iXenorhabdusstockiae HN_xs01)的分离鉴定:采用土壤线虫分离法，结合NBTA鉴别培养基(NBTA培养基)，从云南德宏傣族景颇族自治洲盈江县太平乡采集的土样中直接分离得到一株具有昆虫病原线虫共生菌性状的蓝色细菌，经菌落形态观察、革兰氏染色、镜检和16S rRNA基因同源性分析等方法鉴定该菌株为属，stockiae种,命名为昆虫病原线虫致病杆菌 HN_xs01(J6WorAaA￡//75.stockiae HN_xs01),其 16S rRNA 基因在 Genbank 中的登录号为HQ840745.1。本专利技术之肿瘤靶向细菌一昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01菌剂制备方法: 利用昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01易于培养，发酵周期短的特性，制备该菌`体制剂。主要工艺流程包括菌种活化、一级发酵培养、二级种子罐发酵培养和生产用发酵罐培养，发酵完成后，收集菌液，离心收集菌体，生理盐水洗涤，快速冷冻，真空干燥并包装，-20°C保藏，使用时，根据个体差异用生理盐水溶解通过瘤内或静脉给药。活菌菌剂制备的具体过程如下: (1)菌种活化，将保藏于-80°C冰箱中的昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01划线接种于NBTA培养基上，30°C条件倒置培养36 48 h ;然后挑取单菌落划线，以作进一步的纯化； (2)一级发酵培养和二级种子罐发酵培养:挑取经再次纯化后的stockiae HN_xs01接种LB液体培养基中，30°C下18(T200 rpm振荡培养12h至对数生长中期，然后将10 mL培养液接种于1000 mL LB液体培养基中，30°C下180 200 rpm振荡培养12 24h，得一级种子罐发酵菌液；将二级种子罐在121°C下灭菌30min，装入发酵罐培养基后再灭菌，冷却至25 3(TC，将一级种子罐发酵液按体积比4% 5%接种量接入二级种子罐，通入无菌空气1.8立方米/小时，并以180 rpm的速度搅拌进行培养，培养12 24h，得二级种子罐发酵菌液； (3)生产用发酵罐培养，先将发酵罐灭菌，121°C，压力1.2-1.3 kg/cm2条件下灭菌30min,装入发酵罐培养基后再以121 °C条件灭菌25min，保压降温至25°C 30°C，按体积比4 % 5 %的接种量将二级种子罐发酵液接入发酵罐中培养，通入无菌空气，通气量3升/分钟，温度30°C，搅拌转速为200rpm，培养36h ； (4)制备制剂:当菌体的发酵液密度> 20^171,菌体量不足1020^171时放罐，收集菌液，11000 rpm, 2 min离心收集菌体,生理盐水洗漆6_8遍,先使微生物在极低温度_70°C下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分(真空干燥，真空度-0.1Mpa，真空包装在玻璃瓶中，_20°C保藏，即成。使用时，根据个体差异用生理盐水溶解，通过瘤内或静脉给药。所述培养基的配方及制备: LB液体培养基配方:蛋白胨10 g-Γ1, NaCl 10 g L—1，酵母提取物5 g L—1，水溶，灭菌前pH值7.0 7.4，121 °C，20 min条件湿热灭菌； NBT本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株肿瘤靶向细菌，其特征在于，是昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01，Xenorhabdus?stockiae?HN_xs01；该菌种于2012年03月09日在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏编号为CCTCC?NO：M?2012069。
【技术特征摘要】
1.一株肿瘤靶向细菌，其特征在于，是昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_XS01，Xenorhabdus stockiae HN_xs01 ;该菌种于2012年03月09日在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏编号为CCTCC NO:M 2012069。2.一株制备如权利要求1所述肿瘤靶向细菌菌剂的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)菌种活化，将保藏于_80°C冰箱中的昆虫病原线虫共生致病杆菌HN_xs01划线接种于NBTA培养基上，30°C条件倒置培养36 48 h ;然后挑取单菌落划线，以作进一步的纯化； (2)一级发酵培养和二级种子罐发酵培养:挑取经再次纯化后的stockiae HN_xs01接种LB液体培养基中，30°C下180 200 rpm振荡培养12h至对数生长中期，然后将10 mL培养液接种于1000 mL LB液体培养基中，30°C下180 200 rpm振荡培养12 24h，得一级种子罐发酵菌液；将二级种子罐在121°C下灭菌30min，装入发酵罐培养基后再灭菌，冷却至25 3(TC，将一级种子罐发酵液按体积比4% 5%接种量接入二级种子罐，通入无菌空气1.8立方米/小 时，并以180 rpm的速度搅拌进行培养，培养12 24 h，得二级种子罐发酵菌液； (3)生产用发酵罐培养，先将发酵罐灭菌，121°C，压力1.2-1.3 kg/cm2条件下灭菌30min，装入发酵罐培养基后再以121°C条件灭菌25 min，保压降温至25°C...
【专利技术属性】
技术研发人员：夏立秋，张友明，张超，丁学知，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：
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