本发明专利技术公开了一种CRP单克隆抗体、CRP抗体纳米乳胶微球组合物及制备工艺；所述CRP抗体纳米乳胶微球组合物为不同抗原表位的CRP单克隆抗体，与不同粒径的羧基化聚苯乙烯微球共价交联形成偶联物，然后将不同偶联物按一定比例混合制成CRP单克隆抗体纳米乳胶微球组合物。本发明专利技术所述的CRP单克隆抗体纳米乳胶微球组合物与全自动生化分析仪、特种蛋白分析仪匹配，可全量程测定人全血和血清中C反应蛋白浓度，应用于细菌与病毒性感染的鉴别诊断、药物治疗监测及心血管疾病的风险评估。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医学免疫领域,涉及C反应蛋白(c-reactive protein, CRP)单克隆抗体(Monoclonal antibody, McAb)的制备,涉及C反应蛋白单克隆抗体纳米乳胶微球的偶联，涉及不同C反应蛋白抗体纳米乳胶微球偶联物的组合，还涉及C反应蛋白的检测应用。
技术介绍
C反应蛋白是可在急性炎症病人血清中浓度升高的可以结合肺炎球菌细胞壁C多糖的蛋白质。人类C反应蛋白至少可以有两种存在形式，一种是由五个相同的亚基以非共价键形成五聚体(pentameric CRP, pCRP),这是血清中CRP主要存在形式；另一种为单个亚基的单体(modified/monomeric CRP,mCRP),可由五聚体在活化的血小板膜上分解形成。作为一种急性时相反应蛋白，血浆中CRP浓度在正常人中含量极微，一般新生儿血清CRP水平小于2mg/L，儿童和成人小于10mg/L，但在急性心肌梗死、创伤、感染、炎症、外科手术、肿癌浸润时迅速显著的增高，可达正常水平数百倍甚至上千倍。CRP上升速度、幅度和持续时间与病情和组织损伤的严重程度密切相关，因此作为炎症和组织损伤的非特异性标志物被广泛应用于临床疾病诊断和风险评估。CRP浓度的临床检测方法主要有胶乳凝集法、免疫层析法、化学发光法、放射免疫法、酶联免疫吸附法及乳胶增强比浊法等，其中乳胶增强比浊法是目前公认检测效率最高的方法。CRP检测按其浓度检测范围大致分为两类:第一类是普通CRP检测，检测范围通常在3-200mg/L，但其线性范围不能覆盖微量CRP。第二类是高敏CRP (high-sensitivityCRP, hs-CRP)检测，它比常规检测方法更敏感，灵敏度可低于0.3mg/L,能准确定量0.ri0mg/L浓度范围内的CRP，临床上用于评估心脏病发病风险，但是高敏CRP试剂无法检测更高浓度的CRP。目前在国内用乳胶增强免疫比浊法测定CRP的试剂盒中，其致敏乳胶微球的抗体大多为CRP多克隆抗体(Polyclonal antibody, PcAb),或是采用两种粒径微球分别偶联CRP多克隆抗体后混合作为反应试剂。这些试剂盒有以下不足:首先，虽然多克隆抗体乳胶微球比单克隆抗体乳胶微球具有更高的灵敏度，但线性范围较窄，单独使用不易达到CRP全程测量的要求；其次，单一粒径的微球偶联CRP多克隆抗体制备乳胶微球增强免疫比浊试剂，无法同时测定高浓度和低浓度水平下的CRP含量。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述技术上的不足，提供多株互补配对的CRP单克隆抗体及多克隆抗体，并与纳米乳胶微球偶联，偶联物按比例混合制成组合物，应用于CRP免疫定量试剂盒的制备，可与全自动生化分析仪、特种蛋白分析仪等仪器匹配进行免疫透射和免疫散射比浊测定人全血、血清CRP浓度，实现CRP全量程检测。为实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案:选择高亲和力的CRP单克隆抗体的多株互补配对亚型，用特殊工艺分别与合适粒径的羧基化聚苯乙烯微球偶联，制成CRP单克隆抗体纳米乳胶微球偶联物，该偶联物可按不同的比例与CRP多克隆抗体乳胶微球偶联物混合，从而提闻CRP检测的性能指标。本专利技术可应用于免疫比浊法(散射免疫/透射免疫比浊)测定人血CRP浓度。本专利技术的具体步骤如下:1，从人血清纯化天然CRP作为免疫原，制备高特异性、高亲和力、高纯度的CRP单克隆抗体。2，选择合适粒径的羧基化聚苯乙烯微球，通过1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐(l-Ethyl-3-(3-dimethyl laminopropyl) carbodiimidehydrochloride, EDAC)活化微球表面的羧基，生成活性酯，再与CRP单克隆抗体上的伯胺基反应，形成共价键，完成交联，获得CRP单克隆抗体乳胶微球偶联物。3，选择合适的储存液悬浮CRP单克隆抗体乳胶微球偶联物，或将不同CRP抗体乳胶微球偶联物按一定比例混合，配制成适合CRP检测的试剂，使其同时满足高灵敏度和宽线性范围的要求，用于临床上乳胶增强免疫比浊法检测CRP浓度。步骤I所述的CRP单克隆抗体是用人C反应蛋白免疫，可以是人源性、鼠源性或兔源性等,但并不限于此。CRP单克隆抗体来源可以是杂交瘤细胞免疫动物的腹水，也可以是CHO细胞表达，或杂交瘤无血清培养。纯化方式为硫酸铵沉淀和亲和柱纯化。所获得的抗体具有互补配对的不同抗原识别表位，可以是不同的抗体亚型，其抗原抗体亲和力(affinity) Ka 彡 IXlO8M'步骤2所述的交联方法为碳二亚胺法。碳二亚胺是一类很强的脱水剂，能使羧基与氨基脱水形成酰胺键。本专利技术选用EDAC作为交联剂，它属于碳二亚胺类中可溶于水的一种，适用于蛋白质的偶联。ED AC与羧基反应形成O-酰基异硫脲中间体，该中间体易于水解，在水溶液中很不稳定。该中间体(O-酰基异硫脲)在N-羟基硫代琥珀酰亚胺(N-hydroxysulfosuccinimide, Sulfo-NHS)存在的情况下,可以形成具有与氨基反应活性的NHS-活性酯，这种NHS-活性酯中间体非常稳定。因此，本专利技术选用EDAC和Sulfo-NHS活化羧基微球，可提闻活化效率。步骤2所述的聚苯乙烯微球粒径在50_500nm。其中，小粒径微球偶联弱亲和力单克隆抗体，可提高测试的线性范围。大粒径微球偶联强亲和力单克隆抗体，可提高检测灵敏度。与每毫克聚苯乙烯微球交联的抗体量可根据检测需要进行调整，范围可以是0.03-1毫克。步骤3所述的偶联物，是指CRP单克隆抗体和羧基聚苯乙烯微球共价交联的偶联物，该偶联物可以是同种微球偶联不同亚型的CRP单克隆抗体，也可以是不同粒径微球偶联不同亚型的CRP单克隆抗体。将几种偶联物悬液按不同比例混合，可拓宽CRP乳胶增强免疫比浊法检测的线性范围。本专利技术所述CRP单克隆抗体纳米乳胶微球组合物还涉及乳胶微球的悬浮缓冲液(储存液)和与抗原反应的缓冲液(反应液)。本专利技术所涉及缓冲液可选用具有相似性质的一种或几种:磷酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液、氯化铵缓冲液及甘氨酸缓冲液等。储存液可选择上述一种合适缓冲液，盐浓度在20_300mM。其中可添加蛋白稳定剂，如蔗糖(参考浓度5-15%)、SDS (参考浓度0.005-0.03%)等，还可添加非离子表面活性剂，如 TritonX-1OO (参考浓度 0.005-0.05%)。反应液可选择上述一种合适缓冲液，其中可添加非离子表面活性剂和加速反应的增浊剂，如聚乙二醇4000 (参考浓度0.05-3%)和吐温20 (参考浓度0.01-0.05%)等。溶血剂在检测样本为全血时也可添加。储存液和反应液中可添加防腐剂如叠氮钠(参考浓度小于0.1%)和小牛血清蛋白(参考浓度0.05-1%)。本专利技术具有以下特性与效果:1.本专利技术所涉及的CRP单克隆抗体所使用的免疫原是从人血清纯化而来，比CRP重组蛋白有更多天然抗原表位。通过动物免疫、细胞融合、筛选和克隆化，优选出7C1 (IgG)和OTl(IgG)两种互补配对的杂交瘤细胞亚型。经细胞培养或接种小鼠，获得高亲和力的单抗，其抗原亲和力均高于IXlO8M'本项目建立的杂交瘤细胞大规模培养工艺，使生本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种C反应蛋白（CRP）抗体，其特征是：所述CRP抗体为人血清纯化天然CRP作为免疫原，制备而得的互补配对单克隆抗体或多克隆抗体。
【技术特征摘要】
1.一种C反应蛋白(CRP)抗体，其特征是:所述CRP抗体为人血清纯化天然CRP作为免疫原，制备而得的互补配对单克隆抗体或多克隆抗体。2.如权利要求1所述的CRP抗体，其特征是:所述的单克隆抗体杂交瘤细胞株为7C1和5D1。3.—种CRP单克隆抗体纳米乳胶微球组合物，其特征是:所述纳米乳胶微球组合物为权利要求1或者2所述的单克隆抗体，分别与合适粒径大小的羧基化聚苯乙烯微球在缓冲液中混合，在活化剂的作用下，聚苯乙烯微球上的羧基与抗体上的氨基缩合形成偶联物。4.如权利要求3所述的CRP单克隆抗体纳米乳胶微球组合物，其特征是:所述CRP单克隆抗体是用人血清中C反应蛋白天然抗原免疫小鼠，筛选多个亲和力不同的细胞株，优选互补配对的具有不同抗原识别表位的抗体亚型，其亲和力在IXlO6 -1XlO8 M—1之间或以上。5.如权利要求3所述的CRP单克隆抗体纳米乳胶微球组合物，其特征是:C反应蛋白单克隆抗体的不同种亚型，分别偶联不同直径的聚苯乙烯微球，或者以混合偶联同一种直径的聚苯乙烯微球。6.如权利要求3-5任一项所述的C...
【专利技术属性】
技术研发人员：王雷，李一凡，
申请(专利权)人：深圳伯美生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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