具有因子VII活性的融合蛋白质制造技术

与现有的包含除转铁蛋白之外其他融合伴侣的FVII融合蛋白质相比，根据本发明专利技术的包含因子VII(FVII)和转铁蛋白的融合蛋白质具有提高的FVII比活性，并因此可有效地用于使用FVII的治疗。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及具有因子VII (FVII)活性的融合蛋白质；以及，更特别地，涉及包含FVII和转铁蛋白并且与未融合天然型FVII相比具有0.7或更高的FVII比活性(specificactivity)的融合蛋白质、为其编码的DNA、包含所述DNA的重组载体、以及包含所述重组载体的宿主细胞。
技术介绍
多种出血性疾病由缺乏凝血因子引发。最常见的疾病是分别由凝血因子VIII和IX缺乏或异常引发的血友病A和B。血友病A是由有缺陷的因子VIII基因的X连锁隐性特征(X-1inkedrecessivetrait)所引起的遗传性出血性疾病。血浆源性或重组的因子VIII的浓缩物已被用于治疗血友病A。血友病B是由因子IX缺乏或功能不良而引起的，通过使用血浆源性或重组的因子IX的浓缩物对其进行治疗。但是，出现针对替代因子(replacement factor)的同种抗体仍是血友病A和B的治疗中严重的医学问题。在高至30%的血友病A患者中产生针对因子VIII的抗体。尽管针对因子IX的抗体产生的较少，但它们对免疫耐受诱导治疗较不敏感,导致更严重的结果。凝血由血管壁损伤之后暴露于循环血液的组织因子与激活形式的因子VII(FVIIa)之间形成复合物而引发。这样的复合物激活因子IX和因子X，并且所产生的因子Xa产生有限量的凝血酶。 在正反馈环中，凝血酶激活凝血级联的多种因子(例如，因子VII1、因子V、因子XI等)，并且所激活的因子构成因子X酶复合物(factor Xase complex)或前凝血素酶复合物。这些复合物还扩增其自身的生成并且产生凝血酶。这种被称为“凝血酶爆发(thrombin burst) ”的足够量的凝血酶将出血部位的纤维蛋白原转化为纤维蛋白，从而实现完全止血。但是，在具有针对因子VIII或因子IX的高浓度中和抗体的血友病患者的情况中，因为不能产生上述因子X酶复合物，所以达不到足够的止血。FVIIa已用作主要的治疗剂，用于具有针对因子VIII或因子IX的中和抗体的患者，因为FVIIa可激活因子X(甚至在不存在因子VIII和因子IX时)，从而最终产生足够量的凝血酶以实现期望的治疗效果。FVII是由406个氨基酸组成的单链糖蛋白，分子量为50kDa，并且作为酶原而被分泌到血流中。FVII由四个不同的结构域组成，即，氨基末端-羧基谷氨酸(Gla)结构域、两个表皮生长因子(EGF)样结构域、以及丝氨酸蛋白酶结构域(Hagen FS等，Proc. Natl. Acad.Sc1. USA, 83 (8) =2412-2416,1986)。经过蛋白水解位于Argl52_Ilel53的单个肽键，通过形成由二硫键连接的两个多肽链(即，N末端轻链(24kDa)和C末端重链(28kDa))，FVII被转化为其激活形式FVIIa。FVII以500ng/mL的浓度存在于血浆中，并且1% (即，5ng/mL)的FVII作为FVIIa而存在。同时，已报道血浆中FVII的半衰期为约4小时(3 6小时)，而FVIIa的半衰期为约2. 5小时。由于半衰期短，需要通过多次静脉内注射或连续注射来施用FVIIa。然而，就高治疗费用和使患者不适而言，这会限制FVIIa的治疗应用。为了克服这些问题，已提供方法用于制备包含FVII以及与其相连的融合伴侣的融合蛋白质，但是所产生的蛋白质具有丧失其生物活性的问题，尽管与非融合蛋白质相比，较短的体内半衰期有所提高。因此，有需要提供和获得具有提高的体内半衰期同时保持天然型FVII的生物活性的FVII融合蛋白质。
技术实现思路
技术问题本专利技术的一个目的是提供具有天然型FVII的生物活性的融合蛋白质。本专利技术的另一个目的是提供编码所述融合蛋白质的基因。本专利技术的另一个目的是提供包含所述基因的重组载体。本专利技术的另一个目的是提供包含所述重组载体的宿主细胞。问题的解决方案根据本专利技术的 一个方面，提供了包含因子VII (FVII)和转铁蛋白的融合蛋白质，其中所述转铁蛋白与所述FVII的C末端相连接。根据本专利技术的另一个方面，提供了编码所述融合蛋白质的DNA。根据本专利技术的另一个方面，提供了包含所述DNA的重组载体。根据本专利技术的另一个方面，提供了包含所述重组载体的宿主细胞。专利技术的有益效果根据本专利技术的融合蛋白质具有与天然型FVII相比提高的体内半衰期同时保持FVII的高生物活性，因此可有效地用于使用FVII的治疗。附图简述当与附图结合时，通过以下对专利技术的描述，本专利技术的上述和其他目的及特征将变得显而易见，所述附图分别示出附图说明图1是示意图，其示出用于由包含编码FVII序列的cDNA的载体以及包含编码转铁蛋白(Tf)序列的cDNA的载体构建FVI1-Tf表达载体的克隆流程；图2是示意图，其示出用于通过重叠PCR构建FVI1-GSl (接头)-Tf表达载体的流程;图3 是示意图，其示出包含 GS3、GS5、GS7、GS9、GS11、GS13、GS15 或 GS-1-T 作为接头的FVI1-GS接头-Tf表达载体的构建流程；图 4 显示了本专利技术的 VI1-Tf、FVI1-GSl-Tf、FVI1-GS3_Tf、FVI1-GS5_Tf、FVI1-GS7-Tf、FVI1-GS9-Tf、FVI1-GSll-Tf, FVI1-GS13_Tf、FVI1-GS15_Tf、FVI1-GSl-T-Tf和FVI1-螺旋-Tf(FVI1-Helix-Tf)融合蛋白质，FVI1-白蛋白融合蛋白质(FVI1-Alb)和FVII (诺其 (NovoSeven ))的 Western 印迹结果；图 5 是图表，其示出本专利技术的 FVI1-Tf、FVI1-GSl-Tf、FVI1-GS3-Tf、FVI1-GS5-Tf、FVI1-GS7-Tf、FVI1-GS9-Tf、FVI1-GSll-Tf, FVI1-GS13_Tf、FVI1-GS15_Tf、FVI1-GSl-T-Tf和FVI1-螺旋-Tf融合蛋白质、以及FVI1-白蛋白融合蛋白质(FVI1-Alb)的比活性(specific activity)；图6呈现接头和FVI1-GSl-T-Tf融合蛋白质中两个末端处的限制性识别序列的结构；以及图1 示出经纯化的本专利技术 FVI1-Tf、FVI1-GSl-Tf、FVI1-GSl-T-Tf、FVI1-GS3-Tf 以及FVI1-GS15_Tf融合蛋白质，NovoSeven 和FVII的western印迹结果。专利技术的最佳实施方式本专利技术提供包含因子VII (FVII)和转铁蛋白的融合蛋白质。本专利技术的融合蛋白质的FVII和转铁蛋白可源自任何哺乳动物，优选人。更具体地，本专利技术中所使用的FVII和转铁蛋白可分别具有与见于人血液中那些天然型蛋白质不少于95%的序列同源性。最优选地，FVII具有SEQ ID NO :1的氨基酸序列并且转铁蛋白具有SEQ ID NO : 2的氨基酸序列。此外，用于本专利技术的融合蛋白质的FVII或转铁蛋白可以是其天然型的功能等价物或功能衍生物，其具有基本等价的功能活性。示例性的功能等价物包括由分别在SEQ IDNO :1和2所示的氨基酸序列中缺失、插入或者非保守性或保守性替换任何氨基酸残基或者其组合所诱导的突变体，其中这样的改变基本不改变提供对FVII的生物活性的活性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.06.04 KR 10-2010-00527191.包含因子VII(FVII)和转铁蛋白的融合蛋白质，其中所述转铁蛋白与所述FVII的C末端相连接。2.权利要求1的融合蛋白质，其中所述FVII是氨基酸序列SEQIDNO :1所示的多肽或其功能等价物。3.权利要求2的融合蛋白质，其中所述功能等价物具有与所述FVII的功能活性基本等价的功能活性，并且在SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中具有氨基酸残基的缺失、插入或替换。4.权利要求1的融合蛋白质，其中所述转铁蛋白是氨基酸序列SEQIDNO 2所示的多肽或其功能等价物。5.权利要求4的融合蛋白质，其中所述功能等价物具有与所述FVII的功能活性基本等价的功能活性，并且在SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列中具有氨基酸残基的缺失、插入或替换。6.权利要求1的融合蛋白质，其在所述FVII的C末端与所述转铁蛋白之间还包含限制酶识别序列。7.权利要求1的融合蛋白质，其在所述FVII与所述转铁蛋白之间还包含接头。8.权利要求7的融合蛋白质，其中所述接头由I至100个氨基酸组成。9.权...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋寅瑛，金薰泽，李峰镛，朴万勋，李镐顺，林允挺，李智慧，孙瑞延，金旼善，
申请(专利权)人：SK化学公司，
类型：
国别省市：