本发明专利技术公开了一种基于运动蛋白基因(MovementProtein,MP)的黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumbergreenmottlemoasicvirus,CGMMV）快速分子鉴定的PCR检测方法及在该方法中应用到的引物和探针组合。本发明专利技术采用的引物和探针序列分别为上游引物MMV-F1、下游引物MMV-R1和荧光探针MMV-1；本发明专利技术方法包括以下步骤：（1）取待测样品提取植物组织总RNA，（2）以总RNA为模板，引入所述下游引物MMV-R1进行反转录模板cDNA的合成，（3）将所述上、下游引物和所述荧光探针置于荧光PCR仪中进行实时荧光PCR扩增反应，（4）反应结束后，通过收集的荧光曲线CT值与标准曲线CT值比较，判断检测结果。本发明专利技术可应用于生物物种分子诊断领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于MP基因的黄瓜绿斑驳花叶病毒实时荧光PCR检测方法，以及在该方法中应用到的检测用探针和引物组合。
技术介绍
黄瓜绿斑驳花叶病毒{Cucumbergreen mottle moasic virus, CGMMV)隶属番爺丛矮病毒科{Tombusviridae)烟草花叶病毒属(TbAaffioriry1S),是严重危害葫芦科作物的重要病毒之一，为典型的种传病毒。该病毒于1935年在英国的黄瓜上首次发现并报道，因此命名为黄瓜病毒3 (CV3)和黄瓜病毒4(CV4)，由Anisworth记述。CGMMV株系众多，包括英国和欧洲早期报道的典型株系{Cucumber green mottle mosaic、黄瓜桃叶珊瑚花叶株系{Cucumber aucuba ,日本报道的西瓜株系(Watermelon strain)和日本黄瓜株系(Japanese cucumber strai/ )、洋东株系(Jodo strain)以及印度C株系{Indian strain C)。韩国报道了 CGMMV-KW、CGMMV_KM4、CGMMV-HY 和 CGMMV-K0W 等株系。近几年中国也有一些不同地理株系的报道，如分离自广西、辽宁等地的CGMMV-GX、CGMMV-LN、Liaoning 等。黄瓜绿斑驳花叶病毒在世界范围内广泛分布，主要分布于欧洲的英国、德国、荷兰、丹麦、芬兰、瑞典、希腊、俄罗斯、罗马尼亚、西班牙，南美的巴西，亚洲的以色列、巴基斯坦、伊朗、印度、沙特阿拉伯、日本、韩国等国家和地区。1987年中国台湾已有该病毒的报道。近年来在我国辽宁、广西、广东部分地区发现该病毒为害，造成西瓜、黄瓜、甜瓜、南瓜等农作物不同程度的减产甚至绝收，经济损失非常严重。CGMMV的寄主范围比较窄，包括藜科、茄科和葫芦科植物，主要侵染葫芦科的黄瓜、西瓜、甜瓜、南瓜、苦瓜、丝瓜、`西葫芦和葫芦等植物。CGMMV侵染引起的症状因寄主、环境及株系的不同而有差异，一般造成植株生长缓慢、矮化，叶片斑驳、凹凸、畸形及水疱，果肉变色、腐烂及纤维化。侵染黄瓜后在新叶上出现黄色的小斑点，后期呈花叶并带有浓绿色的突起，叶脉间褪色为绿带状；植株矮化，果实受损严重，表面上产生银白色条斑，产量可下降15% ;侵染西瓜后表现为轻型叶斑驳，植株矮化，果实成熟期症状严重，果实表面形成浓绿色圆斑，内部出现果肉变色和腐烂。在甜瓜上造成茎端新叶出现黄斑，但随叶片老化症状减轻。南瓜植株感病后表现为矮化、绿脉和花叶的等症状。黄瓜绿斑驳花叶病毒主要存在于花粉、种皮、病苗的胚轴、叶片、果实等组织中。是典型的种传病毒，黄瓜新鲜种子的传毒率为8%，保存5个月之后下降到1%，西瓜种子传毒率为5%，土壤带毒率很低。黄瓜叶甲有可能是媒介昆虫，目前没有蚜传的报道。介体菟丝子主要包括 C subinclusa 和 C. campestris。CGMMV引起的病毒病在其发生历史上造成过严重危害。1935年英国最早报道在黄瓜上发生；1969年日本报道过该病的发生，当时被称为“魔芋病”；1974年德国温室黄瓜受到该病毒的影响面积达5% ;1976年前苏联Georgia地区黄瓜上的发病率达到80 100%，导致黄瓜减产30% ；1989年韩国报道该病在大田作物上大面积蔓延，造成巨大经济损失，1998年又在韩国的西瓜和黄瓜上为害，受灾面积达到463hm2，引起“西瓜血瓤病”，造成巨大损失。1987年中国台湾有该病发生危害的报道；2003年在广西的温室南瓜上分离到该病毒；2005年辽中地区的西瓜上大面积发生，造成严重危害，这是大陆首次在大田发生该病的报道。2004 2006年厦门出入境检验检疫局多次从日本进境的南瓜种子中截获该病毒。2009年甘肃局在进口自俄罗斯的黄瓜种子中到截获该病毒。2007年农业部862号公文《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》将其列为重要的对外检疫性有害生物。CGMMV为直杆状病毒，粒子大小约300 X 18nm，核酸为线性单正链RNA，基因组长度约为6. 5kb，为单组份。基因组编码4个蛋白分子，靠近5’端的126kDa和183kDa两个蛋白与病毒的复制有关，其中183kDa是由126kDa蛋白终止子超读产生的；另外两个蛋白分别为约 30kDa 的运动蛋白(Movement protein, MP)和 17. 5kDa 的外壳蛋白(Coat protein,CP)，这两个蛋白分别由不同的亚基因组RNA表达产生。病毒基因组5’端和3’端分别含有一段非编码区(Noncoding region，NCR)，5’端含帽子结构，3’端有一个可以接受组氨酸的类似tRNA状结构。半个世纪来，现代病毒学研究水·平不断提高，病毒的检测技术也在不断发展和改进。目前病毒的检测方法主要包括枯斑和指示植物检测法，血清学检测法，酶标免疫吸附法(ELISA)，电镜负染检测法，免疫电镜检测法，电镜超薄切片法以及常规PCR检测方法。C. Varveri 米用 DAS_ELISA( Double-antibody sandwich ELISA)和F(ab’)2-ELISA两种酶联免疫吸附法对希腊分离物进行检测，并比较了两种方法的检测灵敏度，后者比前者灵敏性高出IO3倍；Shim用DAS-ELISA方法对来自葫芦上表现CGMMV症状的样品进行了定性检测；Choi等将RIPA (Radioimmunoprecipitation Assay,放射免疫沉淀检测法)发展为mult1-RIPA技术，并同时检测西瓜、黄瓜、西葫芦和瓠子上的CGMMV，mult1-RIPA 检测 CGMMV 的最低量为 5OngAil ；Kawai 等使用 M-ELISA ( modified ELISA)检测黄瓜种子，结果比标准ELISA更灵敏，其灵敏度相当于检测到800粒健康种子中的I粒病种。血清学方法是目前普遍运用的常规检测方法，可操作性强，检测结果相对可靠。但是该方法成本较高，周期性长，且灵敏度有限，难以检测含量很少的病毒。RT-PCR是反转录RNA和利用单链寡核苷酸弓I物对特异性DNA片段进行体外快速扩增的方法。张永江等(2008)对葫芦、西瓜、甜瓜3种作物的不同种质资源以及同种种质资源的不同处理进行了 DAS- EL IS A和RT-PCR检测，结果显示受侵染的不同种质资源均可带毒，而RT-PCR方法的灵敏度远高于ELISA，并且建立了直接从葫芦种子中检测CGMMV的技术方法。黄静等(2007)用该方法检测了黄瓜、葫芦、南瓜三种作物的病叶和苋色藜枯斑中的CGMMV病毒，均可以扩增到650bp的目的条带，但是条带清晰度一般，说明检测水平有限。此外，保存于_20°C中的冷冻黄瓜病叶经多次试验均无目的条带，不能对试验条件下保存的样品进行准确检测是该方法的一大缺陷。李红霞等(2007)运用RT-PCR方法对采自甘肃的南瓜果实进行检测，检测结果证明果实中存在CGMMV病毒。Slavokhotov等(2007)针对CP基因设计引物，采用RT-PCR方法检测到了分离自俄罗斯的两个CGMMV病毒株系。Chang等(2005)采用RT-PCR方法从韩国西瓜叶片中检测出CGMMV病毒，得到646bp的CP基因，明确本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于MP基因的黄瓜绿斑驳花叶病毒实时荧光PCR检测用探针和引物组合，其特征在于，它包括上游引物MMV?F1、下游引物MMV?R1和荧光探针MMV?1，其序列分别如下：MMV?F1：5’??CACCTTTATGTCACATTGTTG?3’；MMV?R1：5’??GAATGCATCCTTGTGTCAAC??3’；MMV?1：5’?FAM?CTACAGGATTCCGGTACGTTCCAT?TAMRA?3’。
【技术特征摘要】
1.一种基于MP基因的黄瓜绿斑驳花叶病毒实时荧光PCR检测用探针和引物组合，其特征在于，它包括上游引物MMV-F1、下游引物MMV-Rl和荧光探针MMV-1，其序列分别如下MMV-Fl :5’ - CACCTTTATGTCACATTGTTG-3’ ；MMV-Rl :5’ - GAATGCATCCTTGTGTCAAC -3’ ；MMV-1 :5’ -FAM-CTACAGGATTCCGGTACGTTCCAT-TAMRA-3’。2.一种基于MP基因的利用如权利要求1所述的探针和引物组合对黄瓜绿斑驳花叶病毒进行实时荧光PCR检测的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 (1)取待测样品提取植物组织总RNA； (2)以总RNA为模板，引入所述下游引物MMV-Rl进行反转录模板cDNA的合成； (3)将所述上游引物MMV-Fl、所述下游引物MMV-Rl和所述荧光探针MMV-1置于荧光PCR仪中进行实时荧光PCR扩增反应； (4)反应结束后，荧光PCR仪读取CT值并判断检测结果。3.根据权利要求2所述的基于MP基因的黄瓜绿斑驳花叶病毒实时荧光PCR检测方法，其特征在于，在所述步骤(2)中进行反转录模板cDNA的合成时，其反应体系为Total RNA2. 5u L, 5父？0 缓冲液21^，(1见13 I yL，下游引物 MMV-Rl (10umol/L) 2 y L，反转录酶0. L，加 ...
【专利技术属性】
技术研发人员：张卫东，廖力，王岚，梁玉英，权永兵，迟远丽，徐淼锋，
申请(专利权)人：张卫东，廖力，王岚，梁玉英，权永兵，迟远丽，徐淼锋，
类型：发明
国别省市：
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