封闭系统多阶段核酸扩增反应技术方案

本发明专利技术涉及用于进行多阶段扩增反应的系统、方法和设备，特别是在流体封闭条件下。一方面，本发明专利技术的方法在流体封闭反应系统中进行，所述系统使得能够分离一部分的第一(或在前)反应混合物，并且将其用作第二(或随后)反应混合物中的样品或标本，由此基本上避免仅简单地将两种反应混合物混合在一起时第一反应组分对第二反应可能造成的干扰影响。在该方面，可以将本发明专利技术的系统、方法和设备用于任何扩增反应，该扩增反应允许基于使用嵌套引物的多阶段扩增。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术主要涉及用于分析样品中一种或多种核酸的存在的系统和方法，更具体地，涉及用于在封闭条件下进行多阶段核酸扩增反应，特别是聚合酶链式反应(PCR)的系统和方法。背景核酸扩增反应对于许多研究、医疗和工业应用是极其重要的。这些反应用于临床和生物学研究、检测和监测感染性疾病、检测突变、检测癌症标志物、环境监测、遗传鉴定、生物防御应用中病原体的检测等等，例如Schweitzer等人，Current Opinion in Biotechnology, 12:21-27(2001);Koch, Nature Reviews Drug Discovery,3:749-761 (2004)。特别地，聚合酶链式反应(PCR)已经被应用在所有这些领域中，包括用于病毒和细菌检测、病毒负荷的监测、稀有和/或难以培养的病原体的检测、生物恐怖威胁的快速检测、癌症患者中最少量残留疾病的检测、食物病原体测试、血液供给筛选等等的应用，例如，Mackay, Clin. Microbiol.1nfect, 10:190-212(2004);Bernard et al, ClinicalChemistry, 48:1178-1185 (2002)。关于PCR，如此广泛应用的主要原因是其速度和容易使用(通常使用标准化试剂盒和相对简单和低成本的设备在数个小时内进行)、其灵敏度(经常可以检测到样品中几十个拷贝的靶序列)、以及其可靠性(可以容易地分析低质量样品或保存的样品，例如法医样品或固定的组织样品)，Strachan和Read, Human MolecularGenetics 2 (John ffiley&Sons, New York, 1999)。尽管如此广泛的应用反映出核酸扩增技术中的进步，但依然需要速度和灵敏度上的进一步提高，特别是在感染性疾病检测、最少量残留疾病检测、生物防御应用等等领域中。通过在两阶段扩增反应中使用嵌套的成套引物已经实现了 PCR灵敏度的显著提高，例如，Albert 等人,J. Clin. Microbiol. , 28:1560-1564 (1990) 在此方法中，第一扩增反应的扩增子成为使用新一套引物的第二扩增反应的样品，所述新一套引物中的至少一个结合到第一扩增子的内部位置。尽管提高了灵敏度，但是该方法具有增加试剂操作和增加引入污染序列的风险的问题，其能够导致假阳性。已使用所谓的封闭试管嵌套PCR(closed_tube nested PCR)进行了克服这些困难的尝试；然而，这些方法主要依赖于这样的设计，即将试剂隔离在同一反应容器中不同部分以使得可以通过利用诸如离心等一些物理方法使试剂合在一起来启动第二阶段反应，例如 Yourno, PCR Methods and Applications, 2:60-65(1992) ；ffolff 等人，PCR Methods and Applications, 4:376-379 (1995) ；01mos 等人，Nucleic AcidsResearch, 27:1564-1565(1999)。因此，第一阶段反应组分的相当大部分存在于第二阶段反应中。通过在封闭环境中进行反应也实现了灵敏度的显著提高和假阳性的减少。高灵敏度扩增技术的缺点是由于非靶序列的不当扩增造成的假阳性试验结果的发生，例如，Borst等人,Eur. J. Clin. Microbiol.1nfect. Dis. , 23:289-299 (2004)。非革巴序列的存在可能是由于在反应中缺乏特异性，或者由于来自在前反应的污染(即“携带(carry over) ”污染)，或者由于来自直接环境的污染，例如水、一次性用品、试剂等等。这些问题可通过以下方式来进行改善在封闭容器中进行扩增，以使得一旦加入样品和和试剂并将容器密封，就不再发生对反应物或产物的更多操作。“实时”扩增的出现很大程度上使得所述操作成为可能，该“实时”扩增使用连续报告反应混合物中产物含量的标记。尽管有对封闭容器中多阶段扩增的尝试，现有技术缺乏如下的方法或系统，其中多阶段反应可以在没有来自在前反应的不希望组分(例如引物或其它组分)的干扰影响下进行。因此，亟需进行封闭多阶段扩增反应的新方法，该方法具有单阶段技术的方便，但是其具有使用嵌套引物的多阶段扩增所赋予的更高灵敏度。专利技术简要描述本专利技术提供用于封闭多阶段核酸扩增反应的系统、方法和设备，其中较前阶段反应混合物的一部分作为下一阶段反应的样品。—方面，本专利技术提供检测一种或多种祀多核苷酸是否存在于样品中的方法，其具有以下步骤(a)在流体封闭反应系统中，使用第一阶段扩增试剂在第一反应混合物中扩增来自样品的一种或多种靶多核苷酸，形成一种或多种第一扩增子，所述第一阶段扩增试剂包括针对每一种靶多核苷酸的初始引物；(b)在该流体封闭反应系统中分离第一反应混合物的样品；以及(C)在该流体封闭反应系统中，使用第二阶段扩增试剂在第二反应混合物中扩增该样品中的所述一种或多种第一扩增子，形成一种或多种第二扩增子，所述第二阶段扩增试剂包括针对所述一种或多种第一扩增子的每一种的至少一种次级引物，使得每一种次级引物相对于所述第一扩增子的初始引物均嵌套在所述第一扩增子中。另一方面，本专利技术提供控制嵌套扩增反应的方法，其包括以下步骤(i)在第一阶段扩增反应中，在反应混合物中存在有荧光指示剂的情况下扩增靶多核苷酸，所述荧光指示剂能够产生与第一阶段扩增反应中扩增子数量相关的光信号；(ii)监测第一阶段扩增反应中荧光指示剂的光信号；以及(iii)当光信号达到或超过预定水平时，自动分离有效部分的第一阶段扩增反应的反应混合物来启动第二阶段扩增反应。另一方面，本专利技术提供检测样品中是否存在一种或多种靶多核苷酸的方法，该方法包括以下步骤(i)提供与废料容器、含有样品的样品容器、含有第一阶段扩增试剂的第一反应物容器、以及含有第二阶段扩增试剂的第二反应物容器可选择地流体相通的反应室，每一个所述容器均为流体封闭的；(ii)将样品从样品容器以及第一阶段扩增试剂从第一反应物容器以流体形式转移至反应室，以使得当样品中存在靶多核苷酸时第一阶段扩增试剂与样品在扩增反应中反应，产生含有第一扩增子的反应产物；(iii)除了保留在反应室中的有效部分之外，以流体形式将反应产物转移至废料容器；(iv)将第二阶段扩增试剂从第二反应物容器中以流体形式转移至反应室，以使得当反应产物中存在第一扩增子时第二阶段扩增试剂与有效部分的反应产物在扩增反应中反应，产生第二扩增子；以及(V)检测第二扩增子以确定样品中是否存在靶多核苷酸。另一方面，本专利技术提供确定样品中一种或多种祀多核苷酸的相对量的方法，该方法包括以下步骤(i)在第一扩增反应中，扩增样品中的所述一种或多种靶多核苷酸以及至少一种参照序列，以形成包含每一种靶多核苷酸和参照序列的第一扩增子的第一反应产物，所述第一扩增反应包 括针对每一种靶多核苷酸和参照序列的初始引物；(ii)在第二扩增反应中，从有效部分的第一反应产物扩增所述一种或多种靶多核苷酸的第一扩增子，以形成每一种第一扩增子的第二扩增子，所述第二扩增反应包括针对每一种靶多核苷酸的次级引物，使得每一种第一扩增子的每一种次级引物相对于其初始引物均嵌套在所本文档来自技高网...

【技术保护点】
控制嵌套扩增反应的方法，所述方法包括如下步骤：a)在流体封闭系统的反应室中，进行第一阶段扩增反应，包括使用第一阶段扩增试剂在第一反应混合物中扩增来自样品的一种或多种靶多核苷酸，以形成一种或多种第一扩增子，所述第一阶段扩增试剂包括针对每一种靶多核苷酸的初始引物，其中存在有荧光指示剂的情况下扩增所述一种或多种第一扩增子，所述荧光指示剂能够产生与所述第一阶段扩增反应中的扩增子的数量相关的光信号；b)监测所述第一阶段扩增反应中的荧光指示剂的光信号；c)当所述光信号达到或超过阈水平时，在所述反应室中自动保留有效部分的所述第一阶段扩增反应的反应混合物；以及d)在所述反应室中，使用第二阶段扩增试剂在第二反应混合物中扩增所述有效部分中的一种或多种第一扩增子，以形成一种或多种第二扩增子，所述第二阶段扩增试剂包括针对所述一种或多种第一扩增子中的每一种的至少一种次级引物，使得每一种次级引物相对于所述第一扩增子的初始引物均嵌套在所述第一扩增子中。

【技术特征摘要】
2004.10.27 US 60/622,3931.控制嵌套扩增反应的方法，所述方法包括如下步骤 a)在流体封闭系统的反应室中，进行第一阶段扩增反应，包括使用第一阶段扩增试剂在第一反应混合物中扩增来自样品的一种或多种靶多核苷酸，以形成一种或多种第一扩增子，所述第一阶段扩增试剂包括针对每一种靶多核苷酸的初始引物，其中存在有荧光指示剂的情况下扩增所述一种或多种第一扩增子，所述荧光指示剂能够产生与所述第一阶段扩增反应中的扩增子的数量相关的光信号； b)监测所述第一阶段扩增反应中的荧光指示剂的光信号； c)当所述光信号达到或超过阈水平时，在所述反应室中自动保留有效部分的所述第一阶段扩增反应的反应混合物；以及 d)在所述反应室中，使用第二阶段扩增试剂在第二反应混合物中扩增所述有效部分中的一种或多种第一扩增子，以形成一种或多种第二扩增子，所述第二阶段扩增试剂包括针对所述一种或多种第一扩增子中的每一种的至少一种次级引物，使得每一种次级引物相对于所述第一扩增子的初始引物均嵌套在所述第一扩增子中。2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一阶段扩增反应的所述反应混合物处于流体封闭反应系统的反应室中，并且其中所述步骤c)还包括，除了保留在所述反应室中的所述有效部分外，以流体形式将所述第一阶段反应混合物转移至废料容器。3.如权利要求2所述的方法，其中所述反应室具有底部和位于所述底部之上的出口，使得当所述第一阶段反应混合物以流体形式通过所述出口被转移至所述废料容器时，一定体积的所述第一阶段反应混合物被保留在所述反应室中的出口之下。4.如权利要求3所述的方法，其中保留在所述反应室中的所述体积包括所述有效部分。5.如权利要求2所述的方法，其中所述有效部分是足以含有至少I分子所述扩增子的一定体积的所述反应混合物。6.如权利要求5所述的方法，其中所述有效部分是足以含有至少100分子所述一种或多种第一扩增子的一定体积的所述反应混合物。7.如权利要求2所述的方法，其中所述反应混合物具有一定体积，并且其中所述有效部分是所述反应混合物的体积百分比，所述百分比选自0. 5%至10%的范围。8.如权利要求1所述的方法，其中所述阈水平是基线信号水平的倍数，所述倍数选自1. 5至25的范围。9.如权利要求1所述的方法，其中所述阈水平对应由所述光信号确定的增长曲线的最大、最小或零值。10.如权利要求1所述的方法，其中所述荧光指示剂是特异结合双链DNA的插入染料或者包含特异结合扩增产物的寡核苷酸部分。11.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种第一扩增子通过在所述第一阶段扩增反应中扩增参照序列而产生。12.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种第一扩增子通过在所述第一阶段扩增反应中扩增靶多核苷酸而产生。13.如权利要求1所述的方法，其中所述流体封闭反应系统包括 反应室，其与含有样品的样品容器、含有第一阶段扩增试剂的第一反应物容器以及含有第二阶段扩增试剂的第二反应物容器可选择地流体相通，每一所述容器均为流体封闭的。14.检测样品中是否存在一种或多种靶多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤 a)在流体封闭反应系统的反应室中，使用第一阶段扩增试剂在第一反应混合物中扩增来自样品的一种或多种靶多核苷酸，以形成一种或多种第一扩增子，所述第一阶段扩增试剂包括针对每一靶多核苷酸的初始引物，其中存在有荧光指示剂的情况下扩增所述一种或多种第一扩增子，所述荧光指示剂能够产生与所述第一阶段扩增反应中的扩增子的数量相关的光信号，并且其中所述反应室与废料容器选择性地流体相通； b)监测在所述反应室的所述第一阶段扩增反应中的荧光指示剂的光信号； c)当所述光信号达到或超过预定水平时，在所述反应室中自动保留有效部分的所述第一反应混合物，并且以流体形式将剩下的所述第一反应混合物转移至所述废料容器中； d)将第二阶段扩增试剂引入所述有效部分的所述第一反应混合物中，以在所述反应室中产生第二反应混合物； e)在所述反应室中的所述第二反应混合物中扩增所述一种或多种第一扩增子，所述第二阶段扩增试剂包括针对所述一种或多种第一扩增子中的每一种的至少一种次级引物，使得每一种次级引物相对于所述第一扩增子的初始引物均嵌套在所述第一扩增子中；以及 f)检测所述一种或多种第二扩增子以确定所述样品中是否存在所述一种或多种靶多核苷酸。15.如权利要求14所述的方法，其中所述反应室具有底部和位于所述底部之上的出口，使得当所述第一阶段反应混合物以流体形式通过所述出口被转移至所述废料容器时，一定体积的所述第一阶段反应混合物被保留在所述反应室中的出口之下。16.如权利要求15所述的方法，其中保留在所述反应室中的所述体积包括所述有效部分。17.如权利要求14所述的方法，其中所述有效部分是足以含有至少I分子所述扩增子的一定体积的所述反应混合物。18.如权利要求19所述的方法，其中所述有效部分是足以含有至少100分子所述扩增子的一定体积的所述反应混合物。19.如权利要求18所述的方法，其中所述第一反应混合物具有一定体积，并且其中所述有效部分是所述第一反应混合物的体积百分比，所述百分比选自0. 5%至10%的范围。20.如权利要求14所述的方法，其中所述预定水平是基线信号水平的倍数，所述倍数选自1. 5至25的范围。21.如权利要求14所述的方法，其中所述第一阶段扩增试剂和所述第二阶段扩增试剂包括用于进行聚合酶链式反应或NASBA反应的试剂。22.如权利要求21所述的方法，其中所述荧光指示剂选自特异结合双链DNA的插入染料或者包含特异结合所述第一反应混合物中的扩增产物的寡核苷酸部分。23.如权利要求22所述的方法，其中所述一种或多种扩增子的所述一种通过在所述第一扩增反应混合物中扩增参照序列而产生。24.如权利要求21所述的方法，其中所述流体封闭反应系统是微流装置。25.如权利要求21所述的方法，其中所述流体封闭反应系统包括反应室，其与含有样品的样品容器、含有第一阶段扩增试剂的第一反应物容器以及含有第二阶段扩增试剂的第二反应物容器可选择地流体相通，每一所述容器均为流体封闭的；以及 与回转阀可操作地连接的泵，用于将所述样品和所述第一阶段扩增试剂以流体形式转移至所述反应室，用于当所述光信号等于或高于所述预定水平时自动保留所述有效部分的所述第一反应混合物；以及用于将所述第二阶段扩增试剂以流体形式转移至所述反应室用于扩增所述有效部分中的所述一种或多种第一扩增子。26.检测样品中是否存在一种或多种靶多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤 a)提供包含反应室的流体封闭系统，所述反应室与废料容器、含有样品的样品容器、含有第一阶段扩增试剂的第一反应物容器以及含有第二阶段扩增试剂的第二反应物容器可选择地流体相通； b)将样品从所述样品容器以及将第一阶段扩增试剂从所述第一反应物容器以流体形式转移至所述反应室，以使得当所述样品中存在靶多核苷酸时，所述第一阶段扩增试剂与所述样品在所述反应室中的第一阶段扩增反应中反应，以产生含有第一扩增子的反应产物； c)光学监测在所述反应室的所述第一阶段扩增反应中的荧光指示剂； d)当所述光信号达到或超过阈水平时，除了所述反应室中由所述保留元件保留的有效部分外，以流体形式将所述反应产物转移至所述废料容器； e)将第二阶段扩增试剂从所述第二反应物容器中以流体形式转移至所述反应室，以使得当所述反应产物中存在所述第一扩增子时，所述第二阶段扩增试剂与所述有效部分的所述反应产物在所述反应室的第二扩增反应中反应，以产生第二扩增子；以及 f)检测所述第二扩增子以确定所述样品中是否存在所述靶多核苷酸。27.如权利要求26所述的方法，其中使用所述第一阶段扩增试剂的所述扩增反应是进行预定循环次数的聚合酶链式反应，并且其中在所述扩增反应的预定循环次数之后执行所述以流体形式转移所述反应产物的步骤。28.如权利要求27所述的方法，其中所述扩增反应的所述预定循环次数在20至50的范围内。29.如权利要求26所述的方法，其中所述以流体形式转移所述反应产物的步骤包括以下步骤监测来自与所述第一扩增子相关的荧光指示剂的光信号，所述光信号与所述第一扩增子的数量单一相关；并且当所述光信号等于或高于预定水平时，自动分离所述有效部分的所述反应产物。30.如权利要求29所述的方法，其中所述反应产物具有一定体积，并且其中所述有效部分是所述反应产物的体积百分比，所述百分比选自0. 5%至10%的范围。31.如权利要求30所述的方法，其中所述预定水平是基线信号水平的倍数，所述倍数选自1. 5至2...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗纳德·常，耶苏·陈，道格拉斯·布莱恩·多利特，张建平，詹姆士·建·全·王，温迪·文凯·王，肯德拉·拉腊·保罗，鲁埃尔·凡·阿塔，
申请(专利权)人：塞弗德公司，
类型：发明
国别省市：