本发明专利技术提供了一种利用非哺乳类鱼类资源制备低分子量肝素的方法，其具体步骤为：从鱼类组织中粗提获得未分级肝素组分，用肝素酶降解未分级肝素，得到低分子量肝素冻干纯品，采用咔唑比色法计算含量，使用高效液相质谱联用仪和聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析分子量和纯度，并通过羊血浆法测定抗Ⅱa效价和生色底物法测定抗Ⅹa效价对其活性进行评价。本发明专利技术利用非哺乳类鱼类资源，克服了由于哺乳动物不同种属之间存在的属间交叉病毒和朊病毒感染所带来的不利影响，并改进酶提取方法最终获得高凝血酶活性低分子量肝素。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，尤其是利用非哺乳类鱼类资源，采用改进酶法提取高凝血酶活性低分子量肝素的方法。
技术介绍
凝血是参与维持哺乳动物正常止血的生理途径，在血管受伤的情况下，凝血途径受到激发而形成血凝块，阻止血液损失，血管受伤发生后，血小板立即开始在受伤部位凝集形成物理堵塞物以阻止血液流失。此外，受伤血管也通过血管收缩来减少流经此区域的血流，而血纤维蛋白则开始凝集形成覆盖破裂区域的不溶性网络或凝块。当凝血途径倾向于过量凝结的不平衡状态时，其结果是血栓趋势的形成，通常表现为心脏病发作、中风、深静脉血栓和急性冠状动脉综合征，例如心肌梗死和不稳定型心绞痛。此外，血栓可以弓I发栓塞，并造成肺栓塞或包括中风或短暂缺血性发作在内的脑血管栓塞。目前与凝血途径中的不平衡相关的病变的治疗方法存在很多风险，必须进行谨慎的控制。肝素是一类具有抗凝性质的硫酸化的葡糖胺聚糖的名称。肝素在医学上广泛用作医用介入设备(invasive medical equipment)的涂层剂例如导管和植入体的涂层剂，以及治疗剂和预防剂。此外，已经将肝素与体外循环血液透析一起使用，作为化疗药物和抗炎药物的助剂，作为生长因子的调节剂，并且用于治疗血液动力学紊乱(haemodynamoic disorder)、先兆子痫(pre-eclampsia)、肠炎疾病(inflammator boweldisease)、癌症(cancer)、静脉血栓疾病(venous thromboembolic)、不稳定的冠脉局部缺血疾病(unstablecoronary ischemic disease)和急性脑血管局部缺血(acutecerebravascularisch emia)。肝素是天然的抗凝药物，广泛分布在哺乳动物的肝、肺、心、脾、肾、胸腺、肠黏膜、肌肉和血液中，多与蛋白质结合成复合物存在，这种复合物无抗凝活性，随着蛋白质去除而活性增加。各种组织中肝素的含量与肥大细胞的数目有关，肥大细胞内的颗粒含有肝素或肝素前体，当物理或化学的刺激使肥大细胞脱颗粒时，肝素被释放出来，在体内被肝素酶灭或而通过尿液排泄出去。肝素具有聚合结构，因而肝素组合物通常包含分子量通常为5kDa至40kDa的肝素(例如参见Mulloy et al. , Thromb. Haemost. 84 1052-1056 (2000)) ο分子量范围如此广的肝素通常是指未分级肝素(unfractionatedheparin, UFH)。低分子肝素(low molecular weight heparin, LMWH)是由未分级肝素经化学或酶解聚的方法得到的低相对分子量(Mr)的肝素片段或经分级得到的低Mr肝素组分，Mr范围一般为3000-8000，平均Mr为5000左右。低分子肝素的抗凝血酶FIIa活性远低于其抗Xa因子的活性。LMWH具有抗凝血、抗血栓、调血脂、抗肿瘤等作用，与UHl相比具有以下几个优点它更好地被吸收，并且可以进行皮下给药；在血流中保留更长的时间；具有更可预测的临床响应；可能引起更少的与UFH有关的不利副作用例如出血过多、血小板数量偏低、骨质疏松和刺激注射部位。低分子肝素可从肝素直接分离，或把肝素降解后再纯化得到。分离方法包括有机溶剂分级沉淀法、凝胶色谱法、亲和色谱法、离子交换色谱法和超滤法等。这些方法保持了未分级肝素原有的结构特征和生物学活性，但由于低分子量的成分再UHl中的含量低，不宜于大规模生产。降解方法有肝素酶解法、亚硝酸降解法、过氧化氢降解法、过碘酸降解法、β_消除法、Y-照射法等。不同方法制备得到的LMWH之间结构差异最大之处在于其末端结构，由亚硝酸降解得到的产物，其末端具有无水甘露醇残基，β -消除法的产物具有非硫酸化或2-0-硫酸化的不饱和糖醛酸非还原末端。由于化学降解法反应的剧烈，使得肝素分子中的某些功能基团再反应过程中或多或少被破坏，从而对其某些生物学功能带来一定影响。而酶法降解由于其反应条件温和、便于检测以及生物活性保持较好等特点，成为近年来LMWH提取研究的热点。现在商品肝素主要来源于牛肺、猪肺、猪肠黏膜和羊肺等动物器官。但是，由于认识到哺乳动物不同种属之间存在的属间交叉病毒和朊病毒感染，对源自哺乳动物的LMWH的使用所带来的副作用倍受关注。针对上述问题，本专利技术提供了一种使用极为广泛的非哺乳类鱼类资源，改进酶法提取工艺，获取高凝血活性低分子量肝素的制备方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种利用非哺乳类鱼类资源，采用改进酶法提取高凝血酶活性低分子量肝素的方法，以避免哺乳动物种属之间存在的属间交叉病毒和朊病毒感染，同时改进酶提取方法，提高了低分子量肝素的凝血酶活性。 为解决上述技术问题，本专利技术提供一种制备低分子量肝素的方法，其具体步骤为从鱼类组织中粗提获得未分级肝素组分，用肝素酶降解未分级肝素，得到低分子量肝素冻干纯品，并对其含量和活性进行测定。本专利技术提供的制备低分子量肝素的方法，还包括使用高效液相质谱对所获得的低分子量肝素的纯度和分子量的分析。其中，从鱼类组织中粗提获取未分级肝素组分的步骤为在组织搅拌机中加入等量的鱼类组织和PBS缓冲液进行组织匀浆，将匀浆物中加入40%的NaOH调节pH到9. O,升温至80°C温育3小时，并以IOOOOrpm离心，收集上清液备用；在上清液中加入50%硫酸铵进行盐析步骤，升温至80°C，搅拌I小时，8000 rpm离心，收集上清施加至强碱性阴离子交换树脂，并使用含有4M NaCl的PBS缓冲液对肝素进行洗脱；收集洗脱组分，使用截留分子量为IOOODa的过滤器对洗脱液进行浓缩和脱盐，加入95 %乙醇洗涤2_3次后进行真空冻干处理，即获得未分级肝素冻干品。其中，所述的鱼类为鲑鱼，特别的，所述鱼类组织选自头、皮、鳃和内脏。其中，所述强碱性阴离子交换树脂优选为美国Rohm Hass生产的Amberlite系列、德国拜尔公司生产的Lewatit系列。其中，所述用肝素酶降解未分级肝素获得低分子量肝素的步骤包括取UHl组分溶于PH7. 4的PBS溶液中，充分溶解后离心去除杂质，在上清液中加入肝素酶III (EC4.2. 2. 8)，37°C水浴反应10小时后，不加入相同量的肝素酶III，继续反应10小时，然后水浴升温加热至80°C，I小时候停止反应并IOOOOrpm离心，收集上清液用O. 22 μ m滤膜过滤，加入NaCl固体使其盐浓度未20% (wt)，然后加入90%乙醇，低温静置过夜，直至有沉淀析出，8000 rpm离心20min后,弃去上清收集沉淀,重复上述盐析、脱水步骤,将获得的沉淀冻干处理后即得低分子量肝素纯品。其中，所述低分子量肝素含量的测定的方法采用咔唑比色法。其中，所述低分子量肝素纯度和分子量分析采用高效液相质谱联用仪和聚丙烯酰胺凝胶电泳法。其中，所述高效液相-质谱法的具体操作步骤为将冻干纯品溶解于蒸馏水配制成I μ g/ μ I的浓度，进样5 μ I。流动相A为水/乙腈(85:15 ν/ν)，B为水/乙腈(35:65ν/ν)，两个流动相均含有12mM的三丁基氨TBA和38mM醋酸铵，pH用醋酸调节至6. 5。梯度洗脱程序为0% B流动相洗脱10分钟，开始增加B的使用量，在60分钟内使得B在总流动相中的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备低分子量肝素的方法，其具体步骤为：从鱼类组织中粗提获得未分级肝素组分，用肝素酶降解未分级肝素(UFH)，得到低分子量肝素冻干纯品，分析其分子量，并对其含量和活性进行测定。
【技术特征摘要】
1.一种制备低分子量肝素的方法，其具体步骤为从鱼类组织中粗提获得未分级肝素组分，用肝素酶降解未分级肝素(UFH)，得到低分子量肝素冻干纯品，分析其分子量，并对其含量和活性进行测定。2.如权利要求1所述的制备低分子量肝素的方法，其特征在于，从鱼类组织中粗提获取未分级肝素组分的步骤为在组织搅拌机中加入等量的鱼类组织和PBS缓冲液进行组织匀浆，将匀浆物中加入40%的NaOH调节pH到9. 0，升温至80°C温育3小时，并以IOOOOrpm离心，收集上清液备用；在上清液中加入50%硫酸铵进行盐析步骤，升温至80°C，搅拌I小时，8000 rpm离心，收集上清施加至强碱性阴离子交换树脂，并使用含有4M NaCl的PBS缓冲液对肝素进行洗脱；收集洗脱组分，使用截留分子量为IOOODa的过滤器对洗脱液进行浓缩和脱盐，加入95%乙醇洗涤2-3次后进行真空冻干处理，即获得未分级肝素冻干品。3.如权利要求2所述的制备低分子量肝素的方法，其特征在于，所述的鱼类为海鱼，优选鲑鱼。4.如权利要求2所述的制备低分子量肝素的方法，其特征在于，所述鱼类组织选自头、皮、鳃和内脏。5.如权利要求1一 4任一所述的制备低分子量肝素的方法，其特征在于，用肝素酶降解未分级肝素获得低分子量肝素的步骤包括取UFH组分溶于pH7. 4的PBS溶液中，充分溶解后离心去除杂质，在上清液中加入肝素酶III (EC 4. 2. 2. 8)，37°C水浴反应10小时后，不加入相同量的肝素酶III，继续反应10小时，然后水浴升温加热至80°C，I小时候停止反应并IOOOOrpm离心，收集上清液用O. 22 μ m滤膜过滤，加入NaCl固体使其盐浓度未20% (wt)，然后加入90%乙醇，低温静置过夜，直至有沉淀析出，8000 rpm离心20min后，弃去上清收集沉淀，重复上述盐析、脱水步骤，将获得的沉淀冻干处理后即得低分子量肝素纯品。6.如权利要求1一 5任一所述的制备低分子量肝素的方法，其特征在于，所述低分子量肝素含量的测定的方法采用咔唑比色法。7.如权利要求1一 6任一所述的制备低分子量肝素的方法，其特征在于，所述低分子量肝素纯度和分子量分析采用高效液相质谱联用仪和聚丙烯酰胺凝胶电泳法，其中高效液相-质谱法的具体操作步骤为将冻干纯品溶解于蒸馏水配制成I μ g/ μ I的浓度，进样5 μ 1，流动相A为水/乙腈(85:15 ν/ν)，B为水/乙腈(35:65 ν/ν)，两个流动相均含有12mM的三丁基氨TBA和38mM醋酸铵，pH用醋酸调节至6. 5，梯度洗脱程序为O %B流动相洗脱10分钟，开始增加B的使用量，在60分钟内使得B在总流动相中的比例由0%匀速增加到100%，色谱柱为ZorbaxSB-C18(5ym，0. 5X250mm)...
【专利技术属性】
技术研发人员：曲辉，张春革，李萍，张永勤，
申请(专利权)人：青岛亚博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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