本发明专利技术公开了一种基于位点特异性重组的RNA干扰载体及其构建方法和应用，属于生物技术领域。本发明专利技术所述的干扰载体依次包括以下相连的各部分：与猪的整合素受体β3基因的某单一内含子区域上游进行同源重组的同源重组臂1、人U6启动子序列、多克隆酶切位点、人U6终止子序列、含有PCMV启动子的新霉素抗性基因、与猪的整合素受体β3基因的某单一内含子区域下游进行同源重组的同源重组臂2、复制起始位点基因、氨苄青霉素抗性筛选基因以及用于载体线性化的酶切位点。本发明专利技术的干扰载体实现了对猪源细胞基因组的精确打靶，并为筛选提供了方便，同时还可预期插入片段后对基因表达的影响，对后续实验提供了方便。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种RNA干扰载体及其构建方法和应用，特别涉及一种基于位点特异性重组的RNA干扰载体及其构建方法和应用，属于生物
技术介绍
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。在动物中，RNAi可以通过U6启动表达shRNA来实现。目前的U6载体可以通过2种方式表达在动物细胞内表达瞬时表达以及稳定表达。稳定表达主要是通过插入基因组中实现的。目前主要通过Gateway技术或者是载体随机插入宿主细胞基因组来完成。这些技术的缺陷是无法进行插入位置的直接准确定位，并且随机插入可能影响目的基因的表达。 为了实现稳定表达细胞系中插入基因组位置的准确定位以及不影响相关基因的表达，本专利技术通过U6启动子与同源打靶技术相结合，实现了对猪源细胞的精确打靶，并为筛选提供了方便，同时可预期插入片段后对基因表达的影响，为后续实验提供了方便。
技术实现思路
本专利技术是结合位点特异性同源重组与RNA干扰(RNAi)技术所专利技术的特异性插入猪β 3内含子区域的新型RNAi载体。此处，U6启动子结合同源打靶技术，使得基因组定位更加方便快捷，并且可以确保所筛选工程细胞的目的基因表达不受影响。为了达到上述目的本专利技术采用了以下技术手段本专利技术的一种基于位点特异性重组的RNA干扰载体，其特征在于从5’端开始，包括以下依次相连的各部分与猪的整合素受体β 3基因上某单一内含子区域上游进行同源重组的同源重组臂1、人U6启动子序列、多克隆酶切位点、人U6终止子序列、含有PCMV启动子的新霉素抗性基因、与猪的整合素受体β 3基因上某单一内含子区域下游进行同源重组的同源重组臂2、复制起始位点基因、氨苄青霉素抗性筛选基因以及用于载体线性化的酶切位点，所述的猪的整合素受体β 3基因的GeneBank登录号为NC_010454. 3。其中同源重组臂1、2用于与猪的整合素受体β 3基因上某单一内含子区域进行同源重组；人 启动子用于表达目的shRNA，用于稳定RNAi ；PCMV-NEO:用于抗G418抗性细胞的筛选；复制起始位点(Origin)提供载体在大肠杆菌中的复制信息；Amp promoter-Amp用于筛选阳性克隆或者是菌体的大量增殖；位于人U6启动子序列以及人U6终止子序列之间的多克隆酶切位点用于酶切暴露U6启动子与终止信号之间的粘性末端，便于插入目的ds oligoo在本专利技术中，优选的，所述的与猪的整合素受体￠3基因上某单一内含子区域上游进行同源重组的同源重组臂I是以提取自猪肝组织的DNA为模板，通过使用以下引物扩增得到的引物F: 5 ’ -AAGTCCGGCAGGTGGAGGATTACC-3 ’引物R : 5，-CCCAGTGCTGGTTATCACATGGC-3，；所述的与猪的整合素受体P 3基因上某单一内含子区域下游进行同源重组的同源重组臂2是以提取自猪肝组织的DNA为模板，通过使用以下引物扩增得到的引物F : 5 ’ -GGCCATGTGATAACCAGCACTGGGA-3 ’引物R : 5，-CCCCCTTGTAGTGGACACAGGAGA-3，。在本专利技术中，优选的，所述的载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。进一步的，本专利技术还提供了一种构建以上任一项所述的RNA干扰载体的方法，其特征在于包括以下步骤(I)同源臂的构建以提取自猪肝组织的DNA为模板，设计两对引物分别用来扩增同源重组所使用的同源重组臂I以及同源重组臂2 扩增同源重组臂I所用的引物为F: 5，-AAGTCCGGCAGGTGGAGGATTACC-3’R:5， -CCCAGTGCTGGTTATCACATGGC-3，；同源重组臂2所用的引物为F:5， -GGCCATGTGATAACCAGCACTGGGA-3’R : 5，-CCCCCTTGTAGTGGACACAGGAGA-3，。克隆得到的片段分别连接到PMD20-T载体上，得到分别连有同源重组臂I和同源重组臂2的重组载体PMD20-T-HA1及PMD20-T-HA2 ；(2)人U6启动子、多克隆酶切位点、人U6终止子序列的构建以含人U6启动子、多克隆酶切位点、人U6终止子序列的载体为模板，PCR扩增得到含有人U6启动子、多克隆酶切位点、人U6终止子的片段，将克隆得到的片段连接到PMD20-T载体上，构建得到PMD20-T-U6 ；(3)正筛选基因的构建新霉素抗性基因NEO以及PCMV启动子在载体PGT-Vl上克隆，NEO的扩增引物为F: 5，-ACACGATGATAAGCTTGCCAC-3，R:5’ -TTAGCTAGCGAACCTCTTCGAGGGACCTAATAACTTC-3’ ； PCMV启动子的扩增引物为F: 5 ’ -ACGGGATCCATATACGCGTTGACATTGATTATTGAC-3，R:5’ -GTTCCCGGGAGAGCTCTGCTTATATAGACCTCCC AC-3’ ；(4)骨架载体的构建合成多克隆位点，并将其亚克隆到pUC57载体上，构建骨架载体TOC57-MCS，多克隆位点序列如SEQ ID NO. 2或图13所示；(5)元件组装①利用PMD20-T-HA2载体上的spel与BamHI位点酶切后，将同源重组臂2连接到骨架载体PUC57-MCS上，构建成为载体pUC57-2 ；②PCMV与NEO基因的组装将克隆到的PCMV与NEO基因胶回收后，利用基因上的XmaI酶切位点将两个基因拼接成为PCMV-NE0，将PCMV-NEO克隆到载体pUC57_2上，构建成为载体pUC57-N2 ；③利用PMD20-T-U6 上的 AgeI 与 SalI 以及 PMD20-T-HA1 上的 XmaI 与 SalI 位点，将 HAl 克隆到 PMD20-T-U6 上，构建成 PMD20-T-HA1-U6 ;利用 PMD20-T-HA1-U6 上的 SalI 与ClaI位点将目的片段HA1-U6克隆到pUC57-N2上，构建成为目的载体PSN-U6。在本专利技术中，优选的，步骤(2)中构建得到的含有人U6启动子、多克隆酶切位点、人U6终止子的片段的序列如SEQ ID NO. 3所示。更进一步的，本专利技术还提供了以上任一项所述的RNA干扰载体在构建猪源细胞RNAi表达载体中的应用。在使用本专利技术的载体构建猪源细胞RNAi表达载体时，包括以下步骤1、根据需要选择多克隆位的酶切位点，双酶切载体，暴露PSN-U6上的U6启动子与终止信号之间的粘性末端。2、合成转录shRNA所需的DNA序列，例如步骤I如当选用Clal、SfiI作为酶切位点时，符合本载体的ds-oligo (DNA)如图11所示3、将合成的片段与酶切后的PSN-U6连接，转化连接产物，挑取阳性克隆测序验证，测序引物为5’ -G GACTATCATA TGCTTACCG-3’。 4、大量获得阳性菌液，大提质粒。5、使用载体上自带的合适的平末端酶切位点，酶切载体，使之线性化。6、电本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于位点特异性重组的RNA干扰载体，其特征在于所述的干扰载体依次包括以下相连的各部分：与猪的整合素受体β3基因上某单一内含子区域上游进行同源重组的同源重组臂1、人U6启动子序列、多克隆酶切位点、人U6终止子序列、含有PCMV启动子的新霉素抗性基因、与猪的整合素受体β3基因上某单一内含子区域下游进行同源重组的同源重组臂2、复制起始位点基因、氨苄青霉素抗性筛选基因以及用于载体线性化的酶切位点，所述的猪的整合素受体β3基因的GeneBank登录号为NC_010454.3。
【技术特征摘要】
1.一种基于位点特异性重组的RNA干扰载体，其特征在于所述的干扰载体依次包括以下相连的各部分与猪的整合素受体β 3基因上某单一内含子区域上游进行同源重组的同源重组臂1、人U6启动子序列、多克隆酶切位点、人U6终止子序列、含有PCMV启动子的新霉素抗性基因、与猪的整合素受体β 3基因上某单一内含子区域下游进行同源重组的同源重组臂2、复制起始位点基因、氨苄青霉素抗性筛选基因以及用于载体线性化的酶切位点，所述的猪的整合素受体β 3基因的GeneBank登录号为NC_010454. 3。2.如权利要求1所述的RNA干扰载体，其特征在于所述的与猪的整合素受体β3基因上某单一内含子区域上游进行同源重组的同源重组臂I是以提取自猪肝组织的DNA为模板，通过使用以下引物扩增得到的引物 F: 5 ’ -AAGTCCGGCAGGTGGAGGATTACC-3，引物 R :5，-CCCAGTGCTGGTTATCACATGGC-3，； 所述的与猪的整合素受体β3基因上某单一内含子区域下游进行同源重组的同源重组臂2是以提取自猪肝组织的DNA为模板，通过使用以下引物扩增得到的引物 F :5’ -GGCCATGTGATAACCAGCACTGGGA-3’引物 R :5’ -CCCCCTTGTAGTGGACACAGGAGA-3’。3.如权利要求1或2所述的RNA干扰载体，其特征在于所述的载体的核苷酸序列如SEQID NO.1 所示。4.一种构建权利要求1-3任一项所述的RNA干扰载体的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)同源臂的构建 以提取自猪肝组织的DNA为模板，设计两对引物分别用来扩增同源重组所使用的同源重组臂I以及同源重组臂2 扩增同源重组臂I所用的引物为 F: 5 ’ -AAGTCCGGCAGGTGGAGGATTACC-3，R:5’ -CCCAGTGCTGGTTATCACATGGC-3’ ； 同源重组臂2所用的引物为 F :5’ -GGCCATGTGATAACCAGCACTGGGA-3’R :5，-CCCCCTTGTAGTGGACACAGGAGA-3，。克隆得到的片段分别连接到PMD20-T载体上，得到分别连有同源重组臂I和同源重组臂 2 的重组载体 PMD20-T-HA1 及 PMD20...
【专利技术属性】
技术研发人员：常惠芸，马延滨，丛国正，高闪电，独军政，邵军军，林彤，郝春霞，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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