本发明专利技术公开了产纳他霉素的重组利迪链霉菌及其构建方法与应用。本发明专利技术的构建产纳他霉素的重组利迪链霉菌的方法，包括将纳他霉素合成正调控基因导入作为宿主菌的利迪链霉菌中筛选得到纳他霉素产量高于所述宿主菌的重组利迪链霉菌的步骤；所述纳他霉素合成正调控基因编码如下a）或b）的蛋白质：a）氨基酸序列如SEQ?IDNo.1所示的蛋白质；b）将SEQ?ID?No.1中的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与纳他霉素合成相关的由a）衍生的蛋白质。本发明专利技术的重组利迪链霉菌，具有比野生型显著提高的产纳他霉素和抑菌能力，可以应用于食品、生物能源及饲料添加等方面。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程菌及其构建方法与应用，特别涉及产纳他霉素的重组利迪链霉菌及其构建方法与应用。
技术介绍
随着农作物种植结构的调整和栽培方式的变化，许多作物真菌性病害的发生和危害日趋严重，如甘蓝枯萎病(Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans)、小麦纹枯病菌(R. cereal is)、桃褐腐病菌(M. fructicola)、苹果轮纹病菌(B. berengeriana)、百合根腐病菌(F. oxysporum)等病原菌的危害也十分严重(耿丽华等,2009)。一般的化学农药都难以凑效，且频繁使用增加了病原菌的抗药性，污染了生态环境，因此亟待开发新的、环境友好型的高效微生物农药已成为近年病害生防领域的一大热点。纳他霉素(natamycin)是一种多烯大环内酯类抗生素，也称匹马菌素或游霉素(Pimaricin)，分子式为C33H47O1315研究报道natamycin对几乎所有的酵母菌、霉菌具有抗性，是一种极具有潜力的广谱抗菌剂，能够显著抑制甘蓝枯萎病菌(F. oxysporumf.s. conglutinans)、苹果轮斑病菌(A. mali)、辣椒灰霉病菌(B. cinerea)、葡萄灰霉病菌(B. cinerea)、黄瓜枯萎病菌(F. f. sp. cucumerinum)、爺子早疫病菌(A. solani)、番爺灰霉病菌(B. cinerea)、桃褐腐病菌(M. fructicola)、李子褐腐病菌(M. fructicola)等病原菌的生长，并且不易产生抗药性，在防治植物真菌病害方面显示了良好的应用前景(teWelscher et al. , 2008; Du et al. , 2009;隋勤等，2007)。此外，natamycin 作为食品防腐剂是我国批准使用仅有的2种食品生物防腐剂之一(另一个是乳酸链球菌素，Nisin)，还被应用于临床医疗，用于治疗真菌引起的皮肤和粘膜感染等(Davidson andDoan, 1993;程良英，2010)。
技术实现思路
本专利技术所要解决的一个技术问题是提供纳他霉素产量高的重组利迪链霉菌及其构建方法。本专利技术所提供的构建重组利迪链霉菌的方法，包括将纳他霉素合成正调控基因导入作为宿主菌的利迪链霉菌中筛选得到纳他霉素产量高于所述宿主菌的重组利迪链霉菌的步骤；所述纳他霉素合成正调控基因编码如下a)或b)的蛋白质a)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质；b)将SEQ ID No.1中的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与纳他霉素合成相关的由a)衍生的蛋白质。其中，SEQ ID No.1由192个氨基酸残基组成。上述方法中，所述纳他霉素合成正调控基因的编码序列为SEQ ID No. 2的第433-1011位。所述纳他霉素合成正调控 基因的序列具体可为SEQ ID No. 2的第14-1011位。其中，SEQ ID No. 2由1019个核苷酸组成，第1_13位为Nde I识别位点和保护碱基，第14-432位为红霉素抗性基因启动子，第433-1011位为纳他霉素合成正调控基因的编码序列，第1012-1019为EcoRI识别位点和保护碱基。上述方法中，所述将纳他霉素合成正调控基因导入作为宿主菌的利迪链霉菌包括如下步骤将所述纳他霉素合成正调控基因的表达载体导入大肠杆菌中得到重组大肠杆菌，再将所述重组大肠杆菌与所述作为宿主菌的利迪链霉菌进行双亲接合获得所述重组利迪链霉菌；所述纳他霉素合成正调控基因的表达载体中，启动所述纳他霉素合成正调控基因的启动子是红霉素抗性基因启动子。在本专利技术的一个实施例中，所述红霉素抗性基因启动子的核苷酸序列是SEQIDNo. 3。其中，SEQ ID No. 3由199个核苷酸组成。在本专利技术的实施例中，所述纳他霉素合成正调控基因的表达载体为将所述纳他霉素合成正调控基因插入PIB139的所述红霉素抗性基因启动子下游得到的重组表达载体，具体是将SEQ ID No. 2所示的DNA片段经NdeI和EcoRI酶切后插入pIB139的NdeI和EcoRI位点得到的重组表达载体pIB139-slnM。在本专利技术的实施例中，所述作为宿王囷的利迪链霉囷可为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus) A02CGMCC No. 1654,所述大肠杆菌为去甲基化E. coliET12567(pUZ8002)。本专利技术所要解决的另一个技术问题是提供由上述任一种方法得到的重组利迪链霉菌。 所述重组利迪链霉菌具体可为利迪链霉菌AM02，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 6815。本专利技术所要解决的再一个技术问题是提供所述重组利迪链霉菌的用途。本专利技术所提供的用途是下述I)或2)或3):I)所述重组利迪链霉菌在生产那他霉素中的应用；2)所述重组利迪链霉囷在制备植物病原真囷抑制剂中的应用；3)所述重组利迪链霉菌在抑制植物真菌病害中的应用。上述应用中，所述植物病原真菌为下述至少一种甘蓝枯萎病菌(Fusariumoxysporum f. sp. conglutinans)和西瓜枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. niveum)；所述植物真菌病害为下述至少一种由甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp.conglutinans)引起的病害和由西瓜枯萎病菌(F. oxysporumf. sp. niveum)引起的病害。实验证明，利迪链霉菌(Streptomyceslydicus) AM02 CGMCC No. 6815 纳他霉素产量在YEME培养基上约是野生型菌株利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCCNo. 1654的3倍(图3)，在发酵培养基上约是野生型菌株利迪链霉菌(Streptomyceslydicus) A02 CGMCC No. 1654 的 2 倍(图 4)。利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)AMO2CGMCC No. 6815对甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans)的抑菌活性是利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No. 1654的1. 8倍,对西瓜枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. niveum)的抑菌活性是利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No. 1654的2. 2倍。本专利技术的重组利迪链霉菌，具有比野生型显著提高的产纳他霉素和抑菌能力，由于纳他霉素可以作为食品保鲜剂及饲料添加剂，因此，本专利技术的重组利迪链霉菌可以应用于食品、生物能源及饲料添加等方面。生物材料信息分类命名利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)菌株编号AM02保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称CGMCC地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号保藏日期2012年11月12日保藏中心登记入册编号CGMCC No. 6815下面结合具体实施例详细描述本专利技术，这些实施例用于理解而不是限制本专利技术。附图说明图1 为 pIB139_slnM 的本文档来自技高网...
【技术保护点】
构建重组利迪链霉菌的方法，包括将纳他霉素合成正调控基因导入作为宿主菌的利迪链霉菌中筛选得到纳他霉素产量高于所述宿主菌的重组利迪链霉菌的步骤；所述纳他霉素合成正调控基因编码如下a）或b）的蛋白质：a）氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示的蛋白质；b）将SEQ?ID?No.1中的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与纳他霉素合成相关的由a）衍生的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.构建重组利迪链霉菌的方法，包括将纳他霉素合成正调控基因导入作为宿主菌的利迪链霉菌中筛选得到纳他霉素产量高于所述宿主菌的重组利迪链霉菌的步骤； 所述纳他霉素合成正调控基因编码如下a)或b)的蛋白质 a)氨基酸序列如SEQID No.1所示的蛋白质； b)将SEQID No.1中的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与纳他霉素合成相关的由a)衍生的蛋白质。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述纳他霉素合成正调控基因的编码序列为 SEQ ID No. 2 的第 433-1011 位。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述纳他霉素合成正调控基因的序列为 SEQ ID No. 2 的第 14-1011 位。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述将纳他霉素合成正调控基因导入作为宿主菌的利迪链霉菌包括如下步骤将所述纳他霉素合成正调控基因的表达载体导入大肠杆菌中得到重组大肠杆菌，再将所述重组大肠杆菌与所述作为宿主菌的利迪链霉菌进行双亲接合获得所述重组利迪链霉菌；所述纳他霉素合成正调控基因的表达载体中，启动所述纳他霉素合成正调控基因的启动子是红霉素抗性基因启动子。5...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴慧玲，刘伟成，燕继晔，董丹，刘霆，卢彩鸽，张殿朋，张涛涛，田兆丰，卢向阳，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：
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