本发明专利技术公开了一种重组鲤鱼PKCδ基因、蛋白及其制备与检测方法和应用。重组鲤鱼PKCδ基因具有SEQ?ID?NO:1所示的序列。重组鲤鱼PKCδ蛋白具有SEQ?ID?NO:2所示的序列。本发明专利技术的重组鲤鱼PKCδ蛋白相关的基因克隆及其重组表达具有极其重要的作用，因为研究清楚重组鲤鱼PKCδ基因和蛋白的功能，可以用在提高细胞抗氧化能力，防止细胞氧化损伤，以调控细胞生长等方面，由重组PKCδ蛋白制备的抗体可以检测PKCδ基因在不同种类的细胞、不同的细胞周期及个体的不同发育阶段的表达情况。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种重组鲤鱼PKC S基因、蛋白及其制备与检测方法和应用。
技术介绍
蛋白激酶C (Protein kinase C, PKC)与许多细胞生物效应有关，在细胞信息传递中具有重要作用。由于P K C是促癌剂佛波酯在细胞内的高亲和力受体，因而在肿瘤发生发展中的作用引起人们重视，已发现多种肿瘤组织中PKC含量高于正常。到目前为止，在哺乳动物组织内已确定10种PKC亚类(8-3)，分为A、B、C三组，A组称为典型或传统的 PKC (classicalor conventional PKC，CPKC),包括 a、0 1、II 和Y亚类,其中@1和P II有高度的同源性,是由同一 mRNA的不同剪接而成，A组成员分子量在 76_78kDa。B 组为新型 PKC (atypical PKC，aPKC)，包括 S、e、n (L)和 0 亚类，分子量在77_83kDa。C组为非典型PKC(atypicalPKC，aPKC)，由(和入亚类组成，分子量较小为67kDa。其中，PKC S在调控人和鼠肝细胞生长和抗氧化中起着重要作用。迄今，关于PKC S在哺乳动物细胞生长、增殖和抗氧化中发挥调节作用的研究已在人、大鼠、小鼠等哺乳动物的细胞中开展，并取得了许多成果，但未见有鲤鱼PKC S基因的cDNA核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种重组鲤鱼PKC 6基因、蛋白及其制备与检测方法和应用。 本专利技术解决上述问题所采用的技术方案是一种重组鲤鱼PKC S基因，为下述序列之一 1)序列表中SEQ ID No I所不的基因序列；2)将SEQ ID NO :1所不的基因序列经过一个或几个碱基的取代、缺失或添加且与SEQ ID No :1所示的基因序列表达的氨基酸序列相同的基因序列。一种重组鲤鱼PKC S氨基酸序列，为下述序列之一 1) SEQ ID NO :2所示的由权利要求I所述重组鲤鱼PKC A基因所表达的氨基酸序列；2)将SEQ ID NO : 2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与具有与SEQ ID NO :2的氨基酸序列相同活性的由SEQ ID NO :2序列衍生的蛋白质。一种上述重组鲤鱼PKC 6基因的制备方法，包括下述步骤 1)采集鲤鱼的总RNA并以其肠道组织总RNA为模板进行反转录操作，得到cDNA第一链； 2)以步骤I)中的cDNA第一链为模板，利用引物P1、P2进行PCR扩增，得到SEQID NO:1所示的序列，所述引物Pl具有SEQ ID NO :3所示的序列，引物P2具有SEQ ID NO :4所示的序列；所述步骤2)中以P1、P2为引物，利用DNA聚合酶进行PCR反应的50 u I PCR扩增体系中各组分及其比例为CDNA第一链，2. 5 U I ；50uM的P1，0. 25 U I ;501^的卩2，0. 25u I ；10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Plus) ,5. Ou I ；each 2. 5 mM 的 dNTP Mixture,8. Ou I ；ddH20,33. 5 u I ；5 U/u I 的 DNA 聚合酶，0. 5 ;反应循环条件94°C 预变性 lmin ；94°C变性30sec，60°C退火30 sec，72°C延伸2 min，共40个循环；最后72°C延伸10 min,反应完成。一种上述制备的重组鲤鱼PKC 6基因的检测方法，包括下述步骤 1)将Pl和P2的PCR回收产物的PCR扩增采用2XTaqPCR MasterMix进行，50 y IPCR扩增体系中各组分及其比例为50倍稀释的PKCS回收产物，l.Oiil ;50iiM的P3，0. 25u I ；50uM 的 P4，0.25ii I ；2XTaq PCR MasterMix, 25. 0 u I ；ddH20,23. 5 u I ;反应循环条件94°C预变性lmin ;94°C变性30sec, 6CTC退火30sec, 72°C延伸lmin,共35个循环；最后72°C延伸5 min，反应完成；所述P3具有SEQ ID NO : 5所示的序列，引物P4具有SEQID NO :6所示的序列； 2)取5ill PCR产物用1. 0%琼脂糖凝胶在100V，10 min的条件下进行电泳检测，凝胶成像系统观察分析结果。具体地，该检测方法中，所述50倍稀释的PKC 6回收产物指重组鲤鱼PKC 6基因cDNA编码区核苷酸序列的制备方法中所制备的重组鲤鱼PKC 8基因cDNA序列。一种上述制备的重组鲤鱼PKC 6基因的检测方法，其特征在于，包括下述步骤 1)将Pl和P2PCR回收产物的PCR扩增采用2XTaq PCR Master Mix进行，50 PCR扩增体系中各组分及其比例为50倍稀释的？1((8回收产物，l.Oiil ;50iiM的P5，0. 25iil ；50 u M 的 P6，0. 25ii I ;2XTaq PCR Master Mix，25. 0 ii I ;ddH20，23. 5 ii I ;反应循环条件94°C预变性 lmin ;94°C变性 30sec,60°C (P5, P6)退火 30sec，72°C延伸 lmin，共 35 个循环；最后72°C延伸5min，反应完成；所述P5具有SEQ ID NO : 7所示的序列，引物P6具有SEQ ID NO :8所示的序列； 2)取5ill PCR产物用1. 0%琼脂糖凝胶在100V，10 min的条件下进行电泳检测，凝胶成像系统观察分析结果。上述重组鲤鱼PKC S基因在检测鲤鱼PKC S基因的表达情况中的应用。具体地，鲤鱼PKC S基因的表达情况包括鲤鱼PKC S基因在各类细胞和组织、早期胚胎、个体在不同状态下的表达情况。为了检测上述应用的表达情况，根据SEQ ID NO :1所示序列设计上游引物ro1、下游引物ro2，所述roi具有seq id no :9所示的序列，引物PD2具有SEQ ID NO : 10所示的序列；采用荧光定量PCR扩增，20 PCR扩增体系中各组分及其比例为cDNA，2.0iil ；10uM 的 NDl，1.0iil ；10uM 的 ND2，1.0iil ；SYBR Premh Es Tag n (2X), 10. Ou I ；dH2o,6. o u I;反应循环条件％°C 预变性30sec ;95°C变性5sec，60 °C退火15sec，72°C延伸15sec，共44个循环；最后72°C延伸2min，反应完成。本专利技术研究和开发与鲤鱼PKC S蛋白相关的基因克隆及其重组表达具有极其重要的作用，因为研究清楚鲤鱼的PKC S基因和蛋白的功能，可以用在提高细胞培养存活率、提高细胞抗氧化能力，以调控细胞生长等方面，由重组PKCS蛋白制备的抗体可以检测PKC 6基因在不同种类的细胞、不同的细胞周期及个体的不同发育阶段的表达情况。本专利技术获得的重组PKC S基因的编码区长2061bp，并且确定了其核苷酸序列和由此推断的氨基酸序列。通过比对已知的斑马鱼、人、大鼠、小鼠的PKC S基因的核苷酸序列，找到保守区本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组鲤鱼PKCδ基因，为下述序列之一：1)序列表中SEQ?ID?No：1所示的基因序列；2)?将SEQ?ID?NO:1所示的基因序列经过一个或几个碱基的取代、缺失或添加且与SEQ?ID?No：1所示的基因序列表达的氨基酸序列相同的基因序列。
【技术特征摘要】
1.一种重组鲤鱼PKC S基因，为下述序列之一 1)序列表中SEQ ID No 1所示的基因序列；2)将SEQ ID NO:1所示的基因序列经过一个或几个碱基的取代、缺失或添加且与SEQID No 1所不的基因序列表达的氣基酸序列相同的基因序列。2.一种重组鲤鱼PKC S氨基酸序列，为下述序列之一 1) SEQ ID N0:2所示的由权利要求I所述重组鲤鱼PKC A基因所表达的氨基酸序列；2)将SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与具有与SEQ ID N0:2的氨基酸序列相同活性的由SEQ ID N0:2序列衍生的蛋白质。3.一种权利要求1所述重组鲤鱼PKC S基因的制备方法，其特征在于，包括下述步骤 1)采集鲤鱼的总RNA并以其肠道组织总RNA为模板进行反转录操作，得到cDNA第一链； 2)以步骤I)中的cDNA第一链为模板，利用引物PUP2进行PCR扩增，得到SEQ IDNO:1所示的序列，所述引物Pl具有SEQ ID NO :3所示的序列，引物P2具有SEQ ID NO :4所示的序列；所述步骤2)中以P1、P2为引物，利用DNA聚合酶进行PCR反应的50iU PCR扩增体系中各组分及其比例为cDNA第一链，2. 5 U I ；50uM的P1，0. 25yl ;501^的卩2，0.25u I ；10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Plus) ,5. Ou I ；each 2. 5 mM 的 dNTP Mixture,8.Ou I ；ddH20,33. 5 u I ；5 U/u I 的 DNA 聚合酶，0. 5 ;反应循环条件94°C 预变性 Imin ；94°C变性30sec，60°C退火30 sec，72°C延伸2 min，共40个循环；最后72°C延伸10 min,反应完成。4.一种权利要求3所述制备的重组鲤鱼PKC S基因的检测方法，其特征在于，包括下述步骤 1)将Pl和P2的PCR回收产物的PCR扩增采用2XTaqPCR MasterMix进行，50 ii IPCR扩增体系中各组分及其比例为50倍稀释的？1((6回收产物，l.Oiil ;5011|1的？3，0.25u I ；50uM 的 P4，0. 25 u I ；2XTaq PCR MasterMix, 25. 0 u I ；ddH20,23. 5 u I ;反应循环条件94°C预变性Imin ;94°C变性30sec, 60°C退火30sec, 72°C延伸lmin,共35个循环；最后72°C延伸5 min，反...
【专利技术属性】
技术研发人员：周小秋，姜维丹，冯琳，姜俊，刘扬，李树红，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：
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