本发明专利技术提供了两条人工合成的位点特异性重组酶系统的识别序列及其应用，所述识别序列为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的DNA序列；本发明专利技术人工改造和合成了高效特异的位点特异性重组酶系统的识别序列。利用该识别序列来构建高效特异的位点特异性重组酶系统并应用于植物转基因技术中，用来高效删除不再需要的植物转基因，提高转基因植物的生物安全性和食品安全性，并有利于提高公众对转基因植物及其产品的接受程度。
【技术实现步骤摘要】
两条人工合成的位点特异重组识别序列及其应用
本专利技术属于植物基因工程领域，更具体地，本专利技术涉及人工改造和合成高效特异的位点特异性重组酶系统的识别序列。
技术介绍
位点特异性重组系统(site-specific recombination system)被发现广泛存在于原核生物和低等真核生物，涉及一系列的生物学功能(Wang Y. J.，et al. Recombinase technology: applications and possibilities. Plant Cell Rep. 2011， 30: 267-285)。位点特异重组描述了一类多样化的涉及到特定DNA位点之间发生相互交换的重组进程，其定义涉及到三个方面①需要两段DNA序列合作；②需要一个特殊的重组酶蛋白来识别重组位点并打断和重新连接DNA分子；③遵从磷酸二酯键能量守恒的规律来完成 DNA分子的断裂与再连接过程。其中的位点，或者叫识别位点(recognition site),是指被重组酶识别用以执行重组反应的DNA特定序列。位点特异重组发生在特定的识别位点处， 涉及到DNA片段的切割与再连接，导致DNA片段的整合、删除或颠倒。具体发生哪种重组反应，由两个识别位点的相对方向和位置决定第一种情况下，一对同向的识别位点位于同一 DNA分子上时，重组酶催化删除(excision/deletion)反应，两个识别位点之间的所有片段和一个识别位点将被删除，留下一个识别位点。第二种情况下，一对反向的识别位点位于同一个DNA分子上时，重组酶催化倒位(inversion)反应，将两个识别位点之间的所有片段倒置。第三种情况下，如果一个识别位点位于染色体DNA分子上，另一个识别位点位于游离的质粒或线性DNA分子上，重组酶的催化会发生分子间的片段互换，导致形成杂合染色体，将质粒或线性DNA分子的片段整合到染色体DNA分子上。重组酶的类型按重组酶蛋白的催化结构域所包含的氨基酸残基类型可以将重组酶超级家族分为两个基本族群，分别是酪氨酸家族和丝氨酸家族。按照酶蛋白分子的大小和重组模式，每个家族又可以细分为不同的单个成员。最早和研究最清楚的位点特异重组酶系统包括Cre/loxP，FLP/FRT和R/RS，其中的Cre，FLP和R是双向的酪氨酸家族重组酶，而对应的loxP，FRT和RS则是DNA识别位点。 这类双向的酪氨酸亚家族重组酶介导的遗传交换发生在同一的识别为点之间，在自然条件下这种重组反应是完全可逆的，但是分子内重组(即删除作用)的效率远高于分子间的重组 (整合)。单向的酪氨酸亚家族重组酶的识别位点是非同一的，通常被称为attB(attachment site bacteria)和 attP (attachment site phage)。在缺少称之为删除酶(excisionase) 的辅助蛋白存在下，这一类的重组反应是不可逆的。这一亚家族中已经被证明对基因组操作有用的重组酶包括HK022和改造过的入。根据蛋白酶分子的大小，丝氨酸家族的重组酶也可以分为明显的两类。小分子的丝氨酸亚家族包含 β -six, γ δ-res, CinH_RS2 和 ParA-MRS, 其中 β , y δ , CinH 和 ParA 是重组酶，而six，res, RS2和MRS是对应的DNA识别位点。这一类重组酶虽然也采用同一的识别位点，但实际观察只发现了分子内的删除事件发生，有研究表明由于小分子丝氨酸重组酶的构象扭曲导致了它不能促进分子间的整合反应，因此，由这一类重组酶介导的删除被认为是不可逆的事件。代表大分子丝氨酸亚家族的重组酶包括PhiC31，TP901-l，R4， 和Bxbl。这些重组酶作用在两个序列不同的识别位点上，常称之为attB和attP，重组后产生新的杂合识别位点attL和attR。这类重组酶能够催化删除，倒位和整合反应的发生，但由于重组反应后原始识别位点attB和attP改变成attL和attR,因此逆反应无法发生，除非引入一个删除酶作为第二蛋白辅助。系统及其作用机制1981年，Sternberg和Hamilton在Pl卩遼菌体中发现了 Cre/loxP位点特异性重组系统(Sternberg N, Hamilton D. Bacteriophage Pl site-specific recombination :1. Recombination between IoxP sites. J. Mol. Biol. , 1981, 150(4): 467-486)。Pl 曬菌体侵染宿主之后，其基因组DNA在通常情况下并不整合至宿主染色体，而是以单拷贝可自主复制的环状质粒形式存在于宿主细胞中。通过缺失分析和足迹分析发现这个系统的必须元素包括一个重组酶(命名为Cre)和两个特异性位点(命名为IoxP位点),它们的关系是 Cre重组酶通过特异性识别IoxP位点发生作用。Cre重组酶是由1029bp的一段序列编码的38kD的蛋白，是整合家族中的一员，具有整合家族的特性，即在离体状态下，无辅助因子、拓扑异构酶和DNA不复制时，不需要额外的能量也能够发挥作用。Cre重组酶在水溶液中是以单体的形式存在，其热稳定性较强， 最适反应温度为37°C，甚至在高达46°C的情况下仍有活性，因此Cre重组酶适合在这个温度范围内使用。这一生存温度的广谱性就决定了其能够在哺乳动物的遗传操作中得到广泛应用。Cre重组酶由两个不同区域折叠而成——较大的C-末端结构域和较小的N-末端结构域，中间由一个短链相连。这两个结构域形成“夹子”结构，以便更好地和大小沟充分接触。N-端和序列识别有关，其末端由第20至第120个氨基酸组成；C-端和DNA的结合及DNA链的切割有关，其末端由第132至第341个氨基酸组成，是Cre重组酶的主要活性中心。在重组过程中，Cre重组酶的C-末端构象出现的较大偏差，而2个与Ioxp位点结合的 N-末端结构却相似的现象说明两个亚基中只有一个有剪切活性。LoxP位点是Cre重组酶的特异识别位点，是一个大小为34bp的DNA序列,包括2 个13bp的反向重复序列和一个8bp的非对称间隔区域。其中间隔区和其临近的4bp碱基构成反应的核心区(图1)(王立霞等.Cre重组酶结构与功能的研究进展.生物工程学报，2002，18(5) : 531-535)。间隔区8bp序列是反应的核心部位，重组过程中DNA链的切割和连接均在此进行，而且其非对称性就决定了 IoxP识别序列具有方向性，从而决定了重组的方向性。重组机制是4个Cre重组酶分子和2个IoxP位点结合形成一个复合体，由于识别的对应性，其中只有2个Cre重组酶分子是有活性的。反应进行时，Cre重组酶先与DNA结合，但结合力较弱。当遇到一个IoxP位点时，其结合作用增强，约是原先作用的20倍以上， 但当遇到两个IoxP位点时,其结合能力就更强。在Cre重组酶的作用下两个IoxP位点会发生联会，形成复合体；然后C末端的Tyr-324与DNA分子的3’ -PO4共价结合导致DNA — 条链的切割；切割后另一条链的5’-OH既可与原断裂部位的3’-P04结合恢复原来的构型，也可以与另一切割部位的3’ -PO4结合,形成一个“H本文档来自技高网...
【技术保护点】
一条人工合成的位点特异性重组酶系统的识别序列，其特征在于：所述的识别序列为如下1）、2）、3）或4）的DNA序列：1）具有如SEQ?ID?NO.1所示的DNA序列；2）与1）限定的DNA序列具有80%以上的同源性，且具有与SEQ?ID?NO.1相同功能的DNA序列；3）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且具有与SEQ?ID?NO.1相同功能的DNA序列；4）将SEQ?ID?NO.1的序列经过单核苷酸或寡核苷酸插入、缺失或替换所产生的且与SEQ?ID?NO.1具有相同功能的由SEQ?ID?NO.1衍生的DNA序列。
【技术特征摘要】
1.一条人工合成的位点特异性重组酶系统的识别序列，其特征在于所述的识别序列为如下1)、2)、3)或4)的DNA序列1)具有如SEQID NO.1所示的DNA序列；2)与I)限定的DNA序列具有80%以上的同源性，且具有与SEQID NO.1相同功能的 DNA序列；3)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且具有与SEQID NO.1相同功能的DNA序列；4)将SEQID NO.1的序列经过单核苷酸或寡核苷酸插入、缺失或替换所产生的且与SEQ ID NO.1具有相同功能的由SEQ ID NO.1衍生的DNA序列。2.一条人工合成的位点特异性重组酶系统的识别序列，其特征在于所述的识别序列为如下1)、2)、3)或4)的DNA序列1)具有如SEQID NO. 2所示的DNA序列；2)与I)限定的DNA序列具有80%以上的同源性，且具有与SEQID NO. 2相同功能的 DNA序列；3)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且具有与SEQID NO. 2相同功能的DNA序列；4)将SEQID NO. 2的序列经过单核苷酸或寡核苷酸插入、缺失或替换所产生的且与SEQ ID NO. 2具有相同功能的由SEQ ID NO. 2衍生的DNA序列。3.根据权利要求1或2所述的一条人工合成的位点特异性重组酶系统的识别...
【专利技术属性】
技术研发人员：王锋，胡太蛟，赵永利，
申请(专利权)人：福建省农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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