宏基因组提取方法技术

本发明专利技术公开了宏基因组提取方法，所述方法利用探针杂交磁珠捕获方式降低宿主宏基因组DNA样品中宿主DNA。所述方法利用宿主DNA中的重复序列Alu序列及其两端保守序列作为模板，设计单向或者双向探针，其中每条探针的5’端以生物素修饰，使用包被有链霉亲和素的磁珠捕获与探针杂交的宿主DNA，以达到减弱宏基因组中宿主DNA背景、提高测序数据有效率的目的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及提取宏基因组的方法，具体地涉及降低宿主宏基因组DNA样品中宿主DNA的方法。
技术介绍
宏基因组是出现在某一环境样品中的所有遗传物质，包括许多个体物种的基因组。宏基因组学是指直接从环境样品中获得遗传物质，对宏基因组进行研究的科学。随着高通量DNA测序和生物信息学的发展，宏基因组学的应用价值不断提升。通过分析宏基因组文库，可发现某环境中微生物的群体特征及相互作用规律，探讨微生物与环境的相互影响。对微生物群体DNA的测序，可筛选具有特定功能的基因，获得特殊功能的蛋白。人呼吸道每天接触到大量的病毒和细菌等微生物，对呼吸道宏基因组的研究能有效地了解各微生物群体的特征，从而帮助临床诊断和治疗。在呼吸道宏基因组中，相对于宿主人的基因组含量，病原体基因组含量一般比较小。因此，在呼吸道宏基因组测序中，为达到病原体基因组足够的序列覆盖度，消除宿主基因组的影响是非常重要的。人呼吸道样品中总DNA的质量是宏基因组测序成功与否的关键。对传染病样品，处理DNA污染的方法需要花费比较多的时间，或者收集样品时需要特殊的处理方法。一般提取DNA时，需要利用去垢剂SDS或者溶菌酶、蛋白酶K等裂解细胞，然后利用酚/氯仿抽提，最后乙醇沉淀DNA。在提取宏基因组DNA时，由于细胞类型的多样性以及存在宿主DNA的干扰，所以需要更有效的纯化方法用于DNA的提取。人Alu 重复序列属于短散在序列(short interspersed elements, SINEs)家族。每个Alu序列的长度约280bp，具有可变的多聚A(poly-A)尾巴。Alu重复序列超过一百万条，约占人基因组的10%，已经被用于人类某些遗传疾病的分析。Alu重复序列是不同的，可被分为几个亚家族，是极好的标志物，可被用于检测人类基因组。Alu作为特异的探针，使用PCR技术，可以定量人基因组DNA。在人类基因组中，许多新的Alu序列被发现，并且大部分序列在其他灵长类基因组中不存在，因此依据特异Alu重复序列的分析可作为人类DNA鉴定和定量的有利方法。链霉亲和素包被的磁珠，目前已经广泛应用于生物素化核酸、抗体或其他生物素化配体及靶分子分离和处理。直径为2. 8 μ m的超顺磁珠，具有共价连接到表面并另外用BSA封闭的单层重组链霉亲和素。由于具有单层的链霉亲和素，绝大多数生物素结合位点在空间上不仅可以结合游离生物素，而且还可以结合生物素化的配体。它们显示出快速液相反应动力学特性，并且形状确定的特异性表面便于进行高效捕获、分离和下游操作。实时突光定量PCR (Real-time polymerase chain reaction,简称 Real-timePCR,也被称为 quantitative Real-time polymerase chain reaction,简称 Q-PCR),是基于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,简称PCR)的分子生物学技术,该技术可以对目标片段进行扩增的同时对目标DNA分子进行定量分析。实时荧光定量PCR使用特异的探针序列或者引物，随着扩增过程中DNA模板量的增加，释放出的荧光强度也在增加，因此实时荧光定量PCR可以利用较少的样品，动态检测初始目标DNA的含量。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种提取人类宏基因组的方法，该方法利用探针杂交消减法，能够有效降低宿主宏基因组中宿主DNA背景干扰。本专利技术第一方面，提供了一种，其特征在于利用探针杂交磁珠捕获方式降低宿主宏基因组DNA样品中宿主DNA的影响。根据本专利技术的实施方式，所述探针与所述宿主基因组DNA样品杂交后与所述磁珠偶联。根据本专利技术的实施方式，提供了一种，包括步骤 1)将标记有生物素的所述探针与提取的所述宿主宏基因组DNA样品进行杂交； 2)用包被有链霉亲和素的所述磁珠捕获探针与所述宿主DNA的复合体，并用磁力架分离磁珠-探针-目标DNA复合物； 3)将去除所述磁珠-探针-目标DNA复合物的杂交液以及杂交后的磁珠清洗液进行纯化回收DNA。根据本专利技术的实施方式，所述探针与所述磁珠偶联后与所述宿主基因组的杂交。根据本专利技术的另一个实施方式，提供了一种，包括步骤 1)利用包被有链霉亲和素的所述磁珠与标记生物素的所述探针偶联； 2)将偶联好的复合物与所述宿主宏基因组DNA样品杂交； 3)去除磁珠-探针-目标DNA复合物，对杂交液和杂交清洗液进行纯化回收DNA。根据本专利技术的实施方式，所述的中，在偶联温度下使用多种正反向探针。使用多种正反向探针，可扩大探针与宿主DNA杂交时结合的范围，同时可以充分饱和磁珠上的链霉亲和素位点，提高磁珠的利用效率。根据本专利技术的实施方式，所述的中，在杂交完成之后，对所述磁珠-探针-DNA复合物进行加热或者氢氧化钠法变性，回收偶联有探针的磁珠。回收回收偶联有探针的磁珠，可降低实验成本。根据本专利技术的实施方式，针对人基因组Alu重复序列家族设计探针，通过这些探针杂交消减，达到减少人体DNA在样品中比例的目的。其中探针以多种Alu重复序列家族以及其两端的保守序列为模板，双向设计探针，探针长度在4(T70nt之间，且5’端修饰有生物素。探针序列可选自序列表SEQ ID NO:1 139的人Alu序列。利用人特异的Alu序列，消除呼吸道样品中宿主人基因组的影响，对高通量宏基因组测序有非常显著的帮助。本专利技术第四方面提供了呼吸道样品处理方法，针对不同取样方法、样品物理性质，采用稀释液化、离心收集等方法，最大效率富集样品中的细胞。 该方法不仅适用于用于人呼吸道宏基因组学研究，也适用于人体其他部位例如口腔、消化道、皮肤、生殖道宏基因组学研究，可以有效降低人DNA的高背景干扰，从而有效富集微生物DNA，减少宿主DNA背景引起的测序数据浪费，提高有效数据的产出量，更深入的挖掘宏基因组中微生物信息。附图说明图1为支气管及肺泡灌洗液与气道分泌物总DNA凝胶电泳图。图2为质粒标准品绘制的qPCR标准曲线。图3为实施例1中混合样品原液、杂交液回收液以及磁珠清洗液中质粒qPCR绝对定量扩增曲线。3组曲线簇自左至右分别代表模拟混合DNA原样，杂交液BW，清洗液W，横线表示阈值线。具体实施例方式实验例支气管肺泡灌洗液(BAL)、气道分泌物以及全血总DNA提取 一、支气管肺泡灌洗 对弥漫性间质性肺疾病选择右肺中叶(B4或B5)或左肺舌段，局限性肺病变则在相应支气管肺段进行灌洗。首先在要灌洗的肺段经活检孔通过细硅胶管注入2%利多卡因f 2ml，做灌洗肺段局部麻醉；然后将纤支镜顶端紧密楔入段或亚段支气管开口处，再经活检孔通过硅胶管快速注入37°C灭菌生理盐水。每次25 50ml，总量10(T250ml，一般不超过300ml ;立即用5(Tl00mmHg负压吸引回收灌洗液，通常回收率为40%飞0% ;将回收液体立即用双层无菌纱布过滤除去粘液，并记录总量；装入硅塑瓶或涂硅灭菌玻璃容器中(减少细胞粘附)，置于含有冰块的保温瓶中。二、气道分泌物吸引 选择合适的吸痰管，吸痰管的外径不应超过气管导管内径1/2 ;检查吸痰装置是否完好，吸引负压应不超过-50mmHg ;清洁口腔之后进行纯氧膨肺，气道灌洗。阻断吸痰管负压，将吸痰管插入气管导管作，吸痰后吸净口咽部分泌物。，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种宏基因组提取方法，其特征在于利用探针杂交磁珠捕获方式降低宿主宏基因组DNA样品中宿主DNA的影响。

【技术特征摘要】
2012.09.25 CN 201210361093.11.一种宏基因组提取方法，其特征在于利用探针杂交磁珠捕获方式降低宿主宏基因组DNA样品中宿主DNA的影响。2.根据权利要求1所述的宏基因组提取方法，其特征在于所述探针与所述宿主基因组DNA样品杂交后与所述磁珠偶联。3.根据权利要求2所述的宏基因组提取方法，其特征在于包括步骤 1)将标记有生物素的所述探针与提取的所述宿主宏基因组DNA样品进行杂交； 2)用包被有链霉亲和素的所述磁珠捕获探针与所述宿主DNA的复合体，并用磁力架分离磁珠-探针-目标DNA复合物； 3)将去除所述磁珠-探针-目标DNA复合物的杂交液以及杂交后的磁珠清洗液进行纯化回收DNA。4.根据权利要求1所述的宏基因组提取方法，其特征在于所述探针与所述磁珠偶联后与所述宿主基因组的杂交。...

【专利技术属性】
技术研发人员：任鲁风，王绪敏，楚亚男，高静，谷岚，隋硕，康禹，徐力，袁丽娜，张奕杰，高占成，于军，
申请(专利权)人：中国科学院北京基因组研究所，北京大学人民医院，
类型：发明
国别省市：