本发明专利技术公开了一种人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法，采用胰酶联合弹性蛋白酶消化分离，经过滤、差速贴壁、密度梯度离心及Anti-CD14磁珠分选纯化获得人肺泡II型上皮细胞。本发明专利技术建立了一套分离、培养及鉴定人肺泡II型上皮细胞的方法，并对用该方法培养的细胞的生物学特性维持情况进行了评估，证实该培养方法能够获得纯度很高的人肺泡II型上皮细胞，并较持久地维持细胞生特学特性，从而为进一步深入研究肺泡II型上皮细胞的增殖、分化、液体转运、合成分泌及其在肺损伤、修复等病理生理情况下的功能变化提供了可能。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞的体外培养领域，更具体地，本专利技术涉及一种人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法。
技术介绍
肺泡II 型上皮细胞(alveolar epithelial type II cells, ATII)作为一种组织干细胞，具有十分重要的功能，主要包括5个方面①作为渗透性屏障阻止组织间隙的大分子物质流入肺泡腔；②具有一定组织干细胞功能，在肺损伤修复过程中，除可以自身增殖夕卜，还可分化成为肺泡I型上皮细胞和成纤维细胞；③能分泌肺泡表面活性物质能分泌抗炎、抗菌物质，在免疫方面起作重要作用；⑤能进行跨上皮细胞的钠离子转运，有助于肺泡液体的清除。可见对其进行体外培养研究是十分必要的。自Dobbs等首次报道对成年大鼠肺泡II型上皮细胞提取方法以来，有许多学者进行了这方面的研究，使得该分离培养技术也更加的完善，但体外培养的ATII细胞很快失去表达表面活性质的情况仍然存在，并很快会分化为I型肺泡上皮细胞。尽管分离培养大鼠和人ATII细胞的方法，在十九世纪八十年代已有报道，且在后来的培养方法中也有所完善，然而在维持ATII细胞表型方面仍存在明显不足，如体外培养的ATII细胞很快失去表面活性物质表达特性。而肺腺癌细胞系A549又不具有分化为肺泡I型上皮细胞和成纤维细胞的潜能，失去了 ATII细胞的绝大部分特征。同时也有研究表明人和动物的ATII细胞的生物学特性是有差异的，如不同物种间水通道蛋白(AQPs)表达不同。现有的人肺泡II型上皮细胞分离培养方法是取适量手术后肺组织，剪碎成约Imm3大小后，进入消化过滤步骤，然后进行差速贴壁培养，密度梯度离心及磁珠分选纯化获得人肺泡II型上皮细胞。现有的方法中，消化步骤采用的胰酶和弹性蛋白酶浓度过高，对ATII细胞损伤较大，而且成本较高昂。差速贴壁的时间较短，为1. 5h，还包括应用磁珠分选去除成纤维细胞和巨噬细胞的步 骤，整个实验操作时间过长，至少需要12h工作；提取肺泡II型细胞的肺组织量仍较多，未予以充分利用；实验花费成本高昂。由此可见，人的肺组织作为提取ATII细胞的组织来源，一方面组织来源有限，另一方面体外培养表型维持时间较短，这极大地限制了 ATII细胞的体外培养，以至于国内尚未见这方面研究的报道。因此，为了研究人的ATII细胞的功能，分离纯化、体外培养人ATII细胞是十分必要的。
技术实现思路
基于此，本专利技术提供了一种新的肺泡II型上皮细胞的分离培养方法。一种人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法，包括以下步骤(I)将手术切除边缘肺组织剪碎，BSS洗漆，经细胞筛过滤，留取筛网上组织；(2)加入25-35ml组织消化液，36_38°C消化35_55min，在后10-20分钟加入l_2ml浓度为104U/mL的Dnase I ;每L所述组织消化液的组成为浓度为105U/mL的胰酶2_3ml，浓度为44. 5mg protein/mL的弹性蛋白酶200_500ul ；(3)加入与组织消化液相等体积的抑制液终止消化，滴管吹打，得到细胞悬液；力口入BSS稀释细胞悬液，经细胞筛过滤，收取滤液，离心收集细胞；每L所述抑制液的组成为DMEM/F-1230-60ml，FBS10-20ml、浓度为 104U/ml 的 DNase Il_2ml ；(4)采用36-38°C预热的粘附培养基重悬细胞，置于36_38°C、3_5% CO2、相对温度90-95%的环境下培养2-3h，轻柔收取未贴壁的细胞再次差速贴壁2-3h ;每L所述粘附培养基的组成为DMEM/F-1222. 5_45ml、SAGM22. 5-45ml、FBS5_10ml、浓度为 104U/ml 的 DNaseIl-2ml ；(5)离心收集未贴壁细胞，用DMEM/F-12重悬细胞，并吹打均匀，缓慢加入轻、重分离液的顶部，密度梯度离心；所述轻、重分离液的体积比为1:1 ;所述轻、重分离液的密度分别为1. 040g/ml 和1. 089g/ml ；(6)滴管吸出轻、重分离液界面处的细胞层，BSS洗涤；Ant1-CD14MicroBeads分选去除巨噬细胞，得到分选液；(7)离心分选液收集细胞，用36_38°C预热的含I % FBS的SAGM重悬细胞，吹打均匀后加入SAGM完全培养基中，在36-38 °C、3-5 % CO2、相对温度90-95 %的环境中培养55-75h后换SAGM完全培养基，去除未贴壁细胞，以后隔天换液一次，直到上层没有悬浮细胞，即得人肺泡II型上皮细胞。在其中一个实施例中，步骤( 2)中，每L所述组织消化液的组成为浓度为105U/mL的胰酶2-3ml,浓度为44. 5mg protein/mL的弹性蛋白酶300ul。本专利技术采用胰酶加弹性蛋白酶联合消化法，一方面减少高浓度胰酶对细胞的损伤，另一方面降低弹性蛋白酶的用量，同时也可获得较高的产量。在其中一个实施例中，步骤(3)中，所述细胞筛为串联的100目、200目和325目细胞筛。最上面设置为100目可以过滤大部分的肺组织。在其中一个实施例中，步骤(4)中，所述再次差速贴壁的时间为2. 5h。每L所述粘附培养基的组成为DMEM/F-1222. 5ml、SAGM22. 5ml、FBS5ml、浓度为 104U/ml 的 DNase Ilml0在粘附培养基中加入了 10% FBS，同时将差速贴壁时间延长至2. 5小时，成功去除了成维细胞、绝大部分巨噬细胞和大部分红细胞，减少了磁珠分选去除成纤维细胞的成本。在其中一个实施例中，步骤(5)中，在4°C下，300g密度梯度离心20min。在其中一个实施例中，步骤(7)中，在37°C、5% CO2、相对湿度95%的环境中培养60h后换液。在其中一个实施例中，步骤⑴中，所述细胞筛为100目。本专利技术的人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法在已有方法上作了重要改进，以人肺组织作为细胞提取的组织来源，采用胰酶加弹性蛋白酶联合消化法，一方面减少高浓度胰酶对细胞的损伤，另一方面降低弹性蛋白酶的用量，同时也可获得较高的产量。仅应用磁珠分选去除巨噬细胞，但在粘附培养基中加入了 10% FBS，同时将差速贴壁时间延长至2.5小时，成功去除了成维细胞、绝大部分巨噬细胞和大部分红细胞，省去了应用磁珠分选去除成纤维细胞的步骤，可进一步降低分离成本。成纤维细胞的去除是细胞纯化的关键，如果没能成功去除，在后面的培养过程中很容易形成优势细胞群，导致细胞分离培养失败。经密度梯度离心，Ant1-CDH磁珠分选以及培养60h之后进一步去除上清中未贴壁的细胞，获得的细胞纯度在98%左右。本专利技术建立了一套分离、培养及鉴定人ATII细胞的方法，并对用该方法培养的细胞的生物学特性维持情况进行了评估，证实该培养方法能够获得纯度很高的人ATII细胞，并较持久地维持细胞生特学特性，从而为进一步深入研究肺泡II型上皮细胞的增殖、分化、液体转运、合成分泌及其在肺损伤、修复等病理生理情况下的功能变化提供了可能。附图说明图1为采用pro-SP-C免疫荧光染色法在激光共聚焦显微镜(200 X)下观察人肺泡II型上皮细胞图；图2为人肺泡II型上皮细胞与分子探针LySOTracker Green DND-26共培养后，在激光共聚焦显微镜(200X)下的观察图；图3为透射电镜(4000 X)本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将手术切除边缘肺组织剪碎，BSS洗涤，经细胞筛过滤，留取筛网上组织；(2)加入25?35ml组织消化液，36?38℃消化35?55min，在后10?20分钟加入1?2ml浓度为104U/mL的Dnase?I；每L所述组织消化液的组成为：浓度为105U/mL的胰酶2?3ml，浓度为44.5mg?protein/mL的弹性蛋白酶200?500ul；(3)加入与组织消化液相等体积的抑制液终止消化，滴管吹打，得到细胞悬液；加入BSS稀释细胞悬液，经细胞筛过滤，收取滤液，离心收集细胞；每L所述抑制液的组成为：DMEM/F?1230?60ml，FBS10?20ml、浓度为104U/ml的DNase?I1?2ml；(4)采用36?38℃预热的粘附培养基重悬细胞，置于36?38℃、3?5％CO2、相对温度90?95％的环境下培养2?3h，轻柔收取未贴壁的细胞再次差速贴壁2?3h；每L所述粘附培养基的组成为：DMEM/F?1222.5?45ml、SAGM22.5?45ml、FBS5?10ml、浓度为104U/ml的DNase?I1?2ml；(5)离心收集未贴壁细胞，用DMEM/F?12重悬细胞，并吹打均匀，缓慢加入轻、重分离液的顶部，密度梯度离心；所述轻、重分离液的体积比为1∶1；所述轻、重分离液的密度分别为1.040g/ml和1.089g/ml；(6)滴管吸出轻、重分离液界面处的细胞层，BSS洗涤；Anti?CD14MicroBeads分选去除巨噬细胞，得到分选液；(7)离心分选液收集细胞，用36?38℃预热的含1％FBS的SAGM重悬细胞，吹打均匀后加入SAGM完全培养基中，在36?38℃、3?5％CO2、相对温度90?95％的环境中培养55?75h后换SAGM完全培养基，去除未贴壁细胞，以后隔天换液一次，直到上层没有悬浮细胞，即得人肺泡II型上皮细胞。...
【技术特征摘要】
1.一种人肺泡II型上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)将手术切除边缘肺组织剪碎，BSS洗涤，经细胞筛过滤，留取筛网上组织； (2)加入25-35ml组织消化液，36_38°C消化35_55min，在后10-20分钟加入l_2ml浓度为104U/mL的Dnase I ;每L所述组织消化液的组成为浓度为105U/mL的胰酶2_3ml，浓度为 44. 5mg protein/mL 的弹性蛋白酶 200_500ul ； (3)加入与组织消化液相等体积的抑制液终止消化，滴管吹打，得到细胞悬液；加入BSS稀释细胞悬液，经细胞筛过滤，收取滤液，离心收集细胞；每L所述抑制液的组成为DMEM/F-1230-60ml，FBS10-20ml、浓度为 104U/ml 的 DNase Il_2ml ； (4)采用36-38°C预热的粘附培养基重悬细胞，置于36-38 °C、3-5% CO2、相对温度90-95%的环境下培养2-3h，轻柔收取未贴壁的细胞再次差速贴壁2-3h ;每L所述粘附培养基的组成为DMEM/F-1222. 5_45ml、SAGM22. 5-45ml、FBS5_10ml、浓度为 104U/ml 的 DNaseIl-2ml ； (5)离心收集未贴壁细胞，用DMEM/F-12重悬细胞，并吹打均匀，缓慢加入轻、重分离液的顶部，密度梯度离心；所述轻、重分离液的体积比为1:1 ;所述轻、重分离液的密度分别为1. 040g/ml 和1. 089g/ml ； (6)滴管吸出轻、重分离液界面处的细胞层，BSS洗涤；Ant1-CD14MiCr0BeadS分选去除巨噬细胞，得到分选液； ...
【专利技术属性】
技术研发人员：黎毅敏，毛璞，傅威，吴松林，庞晓青，张容，何为群，刘晓青，
申请(专利权)人：广州呼吸疾病研究所，
类型：发明
国别省市：
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