本发明专利技术涉及一种能应用于水产养殖现场的迟钝爱德华氏菌快速药敏检测试剂盒，本发明专利技术的检测试剂盒，包括有检测板、菌体采集工具、增菌液、药敏检测培养基、比浊管及比色卡；其中检测板包含有用于药敏检测的、包被了含有药物和显色指示剂的检测孔，所述显色指示剂为阿尔玛蓝。本发明专利技术在MH培养基的基础上添加鱼肉蛋白胨、Ca2+和Mg2+，调整NaCl浓度，作为迟钝爱德华氏菌的增菌液，可有效促进迟钝爱德华氏菌的生长，使得增菌液在短时间内达到要求浓度，以缩短药敏检测的时间。同时利用一种对细胞安全、无毒的蓝色染料阿尔玛蓝，对细胞无毒害作用，直接将其包被在药敏检测板微孔内不会影响细菌的生长，从而使得检测操作更加简便、快速，可连续监测细菌增殖动态。?
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于水产致病微生物体外诊断
，具体涉及一种水产动物病原细菌迟钝爱德华氏菌的快速药敏检测试剂盒。
技术介绍
近年来随着水产养殖业的快速发展，水产养殖动物病害问题也日益突出，其中细菌性疾病已在世界范围内对渔业经济造成了巨大的损失。迟钝爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)是一种水产动物重要的致病菌，可以感染包括淡水与海水养殖的多种鱼类，并能在短期内引起大量死亡。目前，在水产养殖生产过程中，抗生素的使用仍是解决水产养殖动物细菌性疾病的重要手段，它能在短期起到良好的治疗效果，但由于抗生素在养殖动物疾病防治上的广泛和长期使用，水产耐药微生物种类及数量得到不断攀升。近年来，抗药性迟钝爱德华氏菌菌株也陆续地被分离到，在这种情况下如果无选择地盲目使用抗生素，不但得不到理想的治疗效果，反应会使得菌株的耐药性进一步加剧，从而给水产养殖业甚至人类生命健康安全带来更为严重的危害。因此，为了有针对性地使用抗生素药物以达到理想的治疗效果，对病原微生物开展抗生素敏感试验，以获知菌株的耐药特性，对于指导临床科学、合理、准确用药，避免疾病的暴发流行及微生物耐药性加剧起着关键性的作用。目前，药敏检测方法主要采用K-B纸片法与肉汤稀释法，其中K-B纸片法一般须在专业的微生物实验室条件下进行，需要具备专业知识的人员来操作完成，存在操作繁琐、工作量大、周期长等问题，而且无法获得药物的最小抑菌浓度(MIC)值。肉汤稀释法虽然可以测定药物的MIC值，但实验周期长，有时需要专业的仪器设备辅助，且对结果判读不够直观。因此，以上两种方法都不适合在养殖生产中应用推广。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能应用于水产养殖现场的迟钝爱德华氏菌快速药敏检测试剂盒，从而弥补现有技术的不足。本专利技术的检测试剂盒，由检测板、菌体采集工具、增菌液、药敏检测培养基、显色指示剂、比浊管和比色卡组成；其中检测板包含有用于药敏检测的、包被了含有不同浓度药物和显色指示剂的检测孔，所述显色指示剂为阿尔玛蓝。所述的菌体采集工具为无菌接种环或无菌吸管；所述的增菌液的，其组份及浓度如下牛肉浸粉6 g/L、可溶性淀粉1. 5 g/L、酪蛋白水解物 17. 5g/L、NaCl 10g/L、CaCl2 2. 8mg/L、MgCl2 4mg/L、鱼肉蛋白胨 10g/L。所述的药敏检测培养基的组成如下牛肉浸粉6 g、可溶性淀粉1. 5 g、酪蛋白水解物 17. 5 g、NaCl 10g、2.8 mg CaCl2、4 mg MgCl2、蒸懼水 I L。所述的包被了含有药物的检测孔，是将药物与海藻糖水溶液混合，加入到检测孔中进行阴干制成。本专利技术检测板还包含有用做质量控制的检测孔和/或生长对照的检测孔。其中质量控制的检测孔和生长对照的检测孔，是将超纯水与海藻糖水溶液混合后加入到检测孔中进行阴干制成。上述的一种检测板，包含有96个检测孔，呈8行X 12列排列。所述的药物为氨苄青霉素、氟苯尼考、链霉素、阿米卡星、土霉素、新霉素、强力霉素、多粘菌素B、复方新诺明、恩诺沙星或利福平。利用本药敏检测试剂盒进行检测的方法按照以下步骤进行I)利用无菌接种环挑取前期分离纯化的迟钝爱德华氏菌单菌落，置于增菌液管内搅动混匀，然后将增菌液管置于28 °C培养箱内震荡培养，直至增菌液浊度与O. 5麦度比浊管的浊度相当。2)将增菌后的菌液以药敏检测培养基将其稀释1500倍，然后分别滴加于药敏检测和生长对照的检测孔内，每孔滴加90 μ I菌液；而质量控制的检测孔内加入90 μ I无菌的药敏检测培养基。3)在每个微孔内加入10 μ I显色指示剂，置于28°C培养箱内避光培养8_12h，取出检测板观察微孔内的颜色，进行药敏结果判读，判读标准如下A、若质控区颜色呈蓝色，则试验有效，可以继续进行判读；若呈粉红色，则试验无效，需重新进行检测。B、若生长对照区呈粉色，则可以继续进行MIC判读；若生长对照区呈蓝色则需将检测板置于28°C培养箱内继续培养，至颜色变为粉红色后，再进行MIC判读。C、若质 控区呈蓝色，生长对照区呈粉红色，则判读各列不同药物对菌体的MIC，其中每列与比色卡上细菌增殖阴性对照区内颜色相同微孔的最低药物包被浓度即为待测弧菌的MIC。 本专利技术根据水生动物病原菌的生长需求，在MH培养基的基础上添加鱼肉蛋白胨、Ca2+和Mg2+，调整了 NaCl浓度，作为迟钝爱德华氏菌的增菌液，可有效促进水产迟钝爱德华氏菌的生长，使得待测菌液在短时间内达到要求浓度，以缩短药敏检测的时间。同时本专利技术利用一种对细胞安全、无毒的蓝色染料阿尔玛蓝作为生长指示剂，基于氧化/还原反应原理，当细菌生长增殖时，由于细菌细胞内生化反应产生的还原力可将阿尔玛蓝显色剂还原，从而使其颜色由氧化态下的蓝色转变为还原态下的粉红色，这一颜色变化可利用肉眼进行直接判断。由于阿尔玛蓝染料对细胞无毒害作用，直接将其加入药敏检测板微孔内不会影响细菌的生长，从而使得检测操作更加简便、快速，而且可连续监测细菌的增殖动态，因此本专利技术是一种简便、快捷、敏感、高效的药敏检测方法。附图说明图1 :本专利技术的一种检测板的不同药物种类及含量的包被示意图。图2 :本专利技术的比色卡的示意图。图3 :不同增菌液配方对迟钝爱德华氏菌生长的影响。具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术进行详细说明。本专利技术试剂盒所用到的组份如下I)药敏检测板为常规96孔细胞培养板，也可是其它类型的细胞培养板；2)菌体采集工具为无菌接种环或一次性无菌塑料接种环3)增菌液的一种配制方法如下牛肉浸粉6 g、可溶性淀粉1. 5 g、酪蛋白水解物17. 5 g、NaCl 10 g、2. 8 mg CaCl2>4 mg MgCl2、鱼肉蛋白胨 10 g、蒸懼水 I L ；4)0. 5 麦氏比浊管，是以 O. 5ml 的 O. 048M BaCl2 溶液与 99. 5ml 的 O. 36M H2SO4 溶液(1%浓度，V/V)混合配制装于密闭的透明小管内；也可选用商品化的麦氏比浊管；5)比色卡其上划分有细菌增殖阳性对照区及细菌增殖阴性对照区(图2)，其中从细菌增殖阴性对照区到细菌增殖阳性对照区的颜色从蓝色(RGB44、19、185)至粉红色(RGB :255，143，218)渐变；6)选用的药品粘附保护剂海藻糖为试剂级纯度大于99%，显色指示剂采用试剂级的阿尔玛蓝染料，该染料是一种对细胞安全、无毒的氧化/还原指示染料，当细菌生长增殖时，由于细菌细胞内生化反应产生的还原力可将阿尔玛蓝染料发生还原，从而使其颜色由氧化态下的蓝色转变为还原态下的粉红色，这一颜色变化可利用肉眼进行直接判断。实施例1 :水产迟钝爱德华氏菌药敏快速检测微孔板的制备1、药物的配置依据水产常用药物种类和禁用药物目录，确定检测药物的种类为氨苄青霉素、氟苯尼考、链霉素、阿米卡星、土霉素、新霉素、强力霉素、多粘菌素B、复方新诺明、恩诺沙星、利福平，共11种。根据不同药物的特性分别采用不同的溶剂准确配制成浓度为6. 4mg/ml、6.4mg/ml、5. 1 2mg/ml、6. 4mg/ml、6. 4mg/ml、5. 12mg/ml、6. 4mg/ml、1. 28mg/ml、5. 12mg/ml、2.56mg/ml、3. 2mg/本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种水产迟钝爱德华氏菌快速药敏检测试剂盒，由检测板、菌体采集工具、增菌液、药敏检测培养基、比浊管和比色卡组成；其中检测板包含有用于药敏检测的、包被了含有药物和显色指示剂的检测孔，所述显色指示剂为阿尔玛蓝。
【技术特征摘要】
1.一种水产迟钝爱德华氏菌快速药敏检测试剂盒，由检测板、菌体采集工具、增菌液、药敏检测培养基、比浊管和比色卡组成；其中检测板包含有用于药敏检测的、包被了含有药物和显色指示剂的检测孔，所述显色指示剂为阿尔玛蓝。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的菌体采集工具为无菌接种环或无菌吸管。3.一种用于权利要求1所述的试剂盒的增菌液，其组份及浓度如下牛肉浸粉6 g/L、可溶性淀粉1. 5 g/L、酪蛋白水解物 17. 5g/L、NaCl 15g/L、CaCl22. 8 mg/L、MgCl2 4 mg/L、鱼肉蛋白胨10g/L。4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的药敏检测培养基的组成如下牛肉浸粉 6 g、可溶性淀粉1. 5 g、酪蛋白水解物 17. 5 g、NaCl 15g、2. 8 mg CaCl2,4 mg MgCl2'蒸馏水I L。5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的包被了含有药物的显色指示剂的检测孔，是将溶解有药物的海藻糖水溶液与显色指示剂阿尔玛蓝混合，加入到检测孔中进行阴干制成。6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的检测板还包含有用做质量控制的检测孔和/或生长对照的检测孔。7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述的质量控制的检测孔和生长对照的检测孔，是将海藻糖水溶液和显色指示剂阿尔玛蓝混合，加入到检测孔中进行阴干制成。8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的比色卡上划分有细菌增殖阳性对照区及细菌增殖阴性对照区，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：刁菁，杨秀生，叶海斌，薛莲，盖春蕾，
申请(专利权)人：山东省海水养殖研究所，
类型：发明
国别省市：
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