本发明专利技术公开了一种防治Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法，本发明专利技术制备的Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体能针对Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎单一感染及混合感染进行有效的防治，解决现有疫苗及血清抗体、卵黄抗体对混合感染治疗无效的困境；同时本发明专利技术采用辛酸沉淀法提取Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体，该法安全、价格低廉，适于大规模生产，且制备的蛋黄抗体纯度高、效价高、性质稳定、易于保存。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及禽类用生物制品
，尤其是一种防治I型和III型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法。
技术介绍
鸭病毒性肝炎(Duck virus h印atitis，DVH)是由鸭肝炎病毒(DHV)引起的一种雏鸭高度致死性、急性传染病。鸭肝炎病毒(duck hepatitis virus, DHV)包含嗜肝病毒科、 星状病毒科和小核糖核酸病毒科3个病毒科的4种病毒。嗜肝病毒科的鸭肝炎病毒引起鸭乙型肝炎，其对鸭没有显著的致病性；星状病毒科引起II型鸭肝炎，目前为止仅英国有发病报道；小核糖核酸病毒科主要引起I型和III型鸭肝炎。I型和III型鸭肝炎在临床症状和病理变化上类似，但中和试验和荧光抗体试验证实二者无共同抗原成分，且III型鸭肝炎病毒的致病力不如I型鸭肝炎病毒。I型鸭肝炎病毒致死性最强，该病毒呈球形或类球形，直径在20-40nm，无囊膜，无血凝性，可在鸭、鸡、鹅胚尿囊腔增殖。病毒抵抗力强，在自然环境中可较长时间存活。由 DHV-1引起的鸭病毒性肝炎主要侵害1-3周龄雏鸭，发病严重，传播迅速，病程短，临床表现为发病急、死亡快，剖解病变特征主要为肝脏有明显的出血点、出血斑，雏鸭通常在出现症状后Ih内死亡，10日龄内的雏鸭感染后死亡率可达90%以上。该病呈世界性分布，首次报道于1945年美国长岛，1954年在英国病鸭中分离到该病毒，德国、意大利、印度、法国、苏联等相继有本病的发生。我国1963年最早报道了该病在上海地区出现，20世纪80年代初期起本病在我国再次流行，之后北京、福建、浙江等多个地区爆发本病，流行区域广，给我国养鸭业造成了严重损失。DHV-1II属于小RNA病毒，直径约30nm,但与I型鸭肝炎病毒无关，由中和抗体试验和荧光抗体实验证实它们没有共同抗原成分。Toth于1969年在美国长岛首次报道了 DHV-1II引起的鸭病毒性肝炎，我国在1998年由刘兆宇等报道了III型DHV感染的发生。该疾病不如I型鸭肝炎病毒感染严重，雏鸭的死亡率很少超过30%，但大体病变与I型鸭肝炎病毒引起的相似。近年来我国不断从病鸭中同时分离到DHV-1和DHV-1II，证明相当多地区的鸭病毒性肝炎为DHV-1和DHV-1II的混合感染，且混合感染的病死率高于任何一种的单一感染，而治愈率低于任何一种的单一感染；而现有的鸭病毒性肝炎疫苗、高免血清或高免卵黄抗体绝大多数是针对I型鸭肝炎病毒研制的，因此对于DHV-1II单一感染及DHV-1和 DHV-1II混合感染的治疗效果均不理想，给鸭病毒性肝炎的防治带来了新的挑战。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种稳定性好、治疗效果明显、特异性强、制备安全方便的防治I型和III型鸭病毒性 肝炎单一感染及混合感染的二价蛋黄抗体的制备方法。为实现本专利技术的目的所采用的技术方案是一种防治I型和III型鸭病毒性肝炎的 二价蛋黄抗体的制备方法，包括以下步骤I.制备I型和III型鸭病毒性肝炎的二价高免鸡蛋(I)选择健康高产蛋鸡隔离饲养，加强饲料营养，同时加喂专用抗生素制剂以预防 细菌感染；(2)制备I型和III型鸭肝炎病毒二价灭活苗A.制水相用冷冻保存的I型和III型鸭病毒性肝炎毒种稀释后分别接种10日龄鸭胚， 24-72h后分别无菌采集死亡鸭胚胚体及胚液，匀浆，冻融后离心，取上清液，等体积混合制 成病毒液并对其进行灭活处理，取灭活后的病毒液与无菌吐温-80进行混合后制成水相；B.制油相取白油、司本-80和硬脂酸铝，并将三种混合，搅拌均匀后，高压灭菌后制成油相；C.制备油乳剂灭活苗将上述步骤I- (2) -A所制得的水相和步骤I- (2) -B所制得的油相进行混匀即 得;(3)免疫产蛋鸡，制备高免鸡蛋将步骤I- (2)所制备的二价灭活苗免疫步骤I- (I)处理过的高产蛋鸡，进行免 疫程序，待效价检测均达到要求后收集鸡蛋，即为I型和III型鸭病毒性肝炎的二价高免鸡 蛋;2.利用步骤I制备的I型和III型鸭病毒性肝炎的二价高免鸡蛋制备蛋黄抗体(I)分离高免鸡蛋蛋黄将步骤I制备的高免鸡蛋进行消毒程序，然后送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分 离；(2)提取卵黄抗体将步骤2- (I)所分离的蛋黄用TBS作为缓冲液，将蛋黄液稀释8倍后，加入0. 2% 的辛酸，沉淀脂类，蛋黄抗体保留在上清液中；再将40%甲醛溶液与该上清液混合，使甲醛 的终浓度达到0. 1% (V/V)，对其进行过滤操作后，取滤液4°C保存备用；(3)配制、保存将步骤2- (2)所得滤液进行I型和III型鸭肝炎病毒抗体效价测定，用0. 01M、 PH7. 2的无菌PBS稀释至中和抗体效价为1:320 ;然后加入终浓度为0. 01%(V/V)的吐温-80 作为稳定剂，搅拌均匀后进行无菌定量分装。上述步骤I- (2)-A中的灭活处理是对病毒液用0. 1%的甲醛37°C密封灭活48h。上述步骤I- (2) -A中病毒液与无菌吐温-80的混合比例为96:4 (V/V)。上述步骤I- (2)-B中白油、司本和硬脂酸铝的混合比例为94:6:2 (V/V/W)。上述步骤I- (2) -C中水相和油相的混合比例为1:2 (V/V)0上述步骤I- (3)中的免疫程序是对免疫产蛋鸡进行肌肉注射，免疫次数为3次， 剂量分别为0. 5ml/只，I. Oml/只，I. 5ml/只，第I次与第2次间隔10天，第2次与第3次 间隔14天，3次免疫后正常饲喂10天，此后每3天取样进行效价检测至I型和III型鸭肝炎 病毒抗体效价均达到要求。上述步骤2- (I)中的消毒程序是对高免鸡蛋用自来水冲洗干净，再用O. 05%的百毒杀浸泡3-5min，然后用纱布擦干，用75%乙醇擦一遍晾干。上述步骤2- (2)中的过滤操作是先充分搅拌均匀后密封60min，再用O. 22 μ m的微孔滤膜过滤。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是(I)本专利技术制备的I型和III型鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体能针对I型和III型鸭病毒性肝炎单一感染及混合感染进行有效的防治，解决现有疫苗及血清抗体、卵黄抗体对混合感染治疗无效的困境。(2)同时本专利技术采用辛酸沉淀法提取I型和III型鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体，该法安全、价格低廉，适于大规模生产，且制备的蛋黄抗体纯度高、效价高、性质稳定、易于保存。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例本专利技术所涉防治I型和III型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法，其步骤为1.制备I型和III型鸭病毒性肝炎的二价高免鸡蛋(I)选择健康高产蛋鸡隔离饲养，加强饲料营养，同时加喂专用抗生素制剂以预防细菌感染；(2)制备I型和III型鸭肝炎病毒二价灭活苗A.制水相用冷冻保存的I型和III型鸭病毒性肝炎毒种稀释后分别接种10日龄鸭胚， 24-72h后分别无菌采集死亡鸭胚胚体及胚液，匀浆，冻融后离心，取上清液，等体积混合制成病毒液并对其进行灭活处理，取灭活后的病毒液与无菌吐温-80进行混合后制成水相， 病毒液与无菌吐温-80的混合比例为96:4 (V/V)；所述灭活处理是对病毒液用O. 1%的甲醛37°C密封灭活48h。B.制油相取白油、司本-80和硬脂酸铝，并将三种本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种防治Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：?1）制备Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价高免鸡蛋；?（1）选择健康高产蛋鸡隔离饲养，加强饲料营养，同时加喂专用抗生素制剂以预防细菌感染；?（2）制备Ⅰ型和Ⅲ型鸭肝炎病毒二价灭活苗；?A.制水相；?用冷冻保存的Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎毒种稀释后分别接种10日龄鸭胚，24?72h后分别无菌采集死亡鸭胚胚体及胚液，匀浆，冻融后离心，取上清液，等体积混合制成病毒液并对其进行灭活处理，取灭活后的病毒液与无菌吐温?80进行混合后制成水相；?B.制油相；?取白油、司本?80和硬脂酸铝，并将三种混合，搅拌均匀后，高压灭菌后制成油相；?C.制备油乳剂灭活苗；?将上述步骤1?（2）?A所制得的水相和步骤1?（2）?B所制得的油相进行混匀即得；?（3）免疫产蛋鸡，制备高免鸡蛋；?将步骤1?（2）所制备的二价灭活苗免疫步骤1?（1）处理过的高产蛋鸡，进行免疫程序，待效价检测均达到要求后收集鸡蛋，即为Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价高免鸡蛋；?2）利用步骤1制备的Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价高免鸡蛋制备蛋黄抗体；?（1）分离高免鸡蛋蛋黄；?将步骤1制备的高免鸡蛋进行消毒程序，然后送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分离；?（2）提取卵黄抗体；?将步骤2?（1）所分离的蛋黄用TBS作为缓冲液，将蛋黄液稀释8倍后，加入0.2%的辛酸，沉淀脂类，蛋黄抗体保留在上清液中；再将40%甲醛溶液与该上清液混合，使甲醛的终浓度达到0.1%（V/V），对其进行过滤操作后，取滤液4℃保存备用；?（3）配制、保存；?将步骤2?（2）所得滤液进行Ⅰ型和Ⅲ型鸭肝炎病毒抗体效价测定，用0.01M、pH7.2的无菌PBS稀释至中和抗体效价为1:320；然后加入终浓度为0.01%（V/V）的吐温?80作为稳定剂，搅拌均匀后进行无菌定量分装。...
【技术特征摘要】
1.一种防治I型和III型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤.1)制备I型和III型鸭病毒性肝炎的二价高免鸡蛋；(1)选择健康高产蛋鸡隔离饲养，加强饲料营养，同时加喂专用抗生素制剂以预防细菌感染；(2)制备I型和III型鸭肝炎病毒二价灭活苗；A.制水相；用冷冻保存的I型和III型鸭病毒性肝炎毒种稀释后分别接种10日龄鸭胚，24-72h后分别无菌采集死亡鸭胚胚体及胚液，匀浆，冻融后离心，取上清液，等体积混合制成病毒液并对其进行灭活处理，取灭活后的病毒液与无菌吐温-80进行混合后制成水相；B.制油相；取白油、司本-80和硬脂酸铝，并将三种混合，搅拌均匀后，高压灭菌后制成油相；C.制备油乳剂灭活苗；将上述步骤1- (2)-A所制得的水相和步骤1- (2)-B所制得的油相进行混匀即得；(3)免疫产蛋鸡，制备高免鸡蛋；将步骤1- (2)所制备的二价灭活苗免疫步骤1- (1)处理过的高产蛋鸡，进行免疫程序，待效价检测均达到要求后收集鸡蛋，即为I型和III型鸭病毒性肝炎的二价高免鸡蛋；.2)利用步骤I制备的I型和III型鸭病毒性肝炎的二价高免鸡蛋制备蛋黄抗体；(1)分离高免鸡蛋蛋黄；将步骤I制备的高免鸡蛋进行消毒程序，然后送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分离；(2)提取卵黄抗体；将步骤2- (1)所分离的蛋黄用TBS作为缓冲液，将蛋黄液稀释8倍后，加入0. 2%的辛酸，沉淀脂类，蛋黄抗体保留在上清液中；再将40%甲醛溶液与该上清液混合，使甲醛的终浓度达到0. 1% (V/V)，对其进行过滤操作后，取滤液4°C保存备用；(3)配制、保存;将步骤2- (2)所得滤液进行I型和III型鸭肝炎病毒抗体效价测定，用0. 01M、pH7. 2的无菌PBS稀释至中和抗体效价为1:320 ;然后加入终浓度为0.01% (V/V)的吐温-8...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋秀梅，王建，刘丽丽，殷立伟，葛兆宁，王震，
申请(专利权)人：天津市中升挑战生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。