本发明专利技术提供了一种肺炎支原体(MP)抗原，该抗原的抗原片段为MP371或MP661。MP371位点位于MP黏附蛋白P1的N末端371-480aa；MP661位点位于MP黏附蛋白P1的N末端661-772aa。本发明专利技术还涉及含有上述任何一种抗原或抗原组合物的试剂盒及其在检测肺炎支原体抗体中的应用。本发明专利技术采用提供的肺炎支原体抗原是由密码子优化的基因克隆表达的重组抗原，较MP培养提取的抗原特异性强。本发明专利技术提供的试剂盒可以特异性的检测临床样本中的抗MP-IgM抗体，从而实现对肺炎支原体早期感染的鉴别诊断。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及肺炎支原体(MP)黏附蛋白I(Pl)密码子优化基因、其抗原、其抗原组合物，还涉及含有该抗原或抗原组合物的试剂盒和应用。
技术介绍
肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia, MP)感染在临床上引起非典型肺炎和支气管炎，严重者可以导致呼吸道以外的并发症，如急性弥散性脑脊髓炎、血液系统、运动系统损害等，感染对象多为5岁以下的儿童。MP引发的肺炎与其他病原引发的肺炎症状相似，但MP没有细胞壁结构，临床用药主要采用以可渗入细胞内的大环内酯类抗生素，如罗红霉素、红霉素、阿奇霉素等，而对常规肺炎治疗采用的抗生素类药物，如青霉素、头孢等(主要是抑制病原体细胞壁合成类药物)，并不敏感。因此，MP的鉴别诊断对临床合理用药具有很好的指导意义。目前MP的实验室检测主要有分离培养法、血清学检测、核酸检测。分离培养法是MP检测的金标准法，但由于MP生长缓慢，周期长，且阳性率低，无法作为临床常规检测手段。核酸检测主要针对 患者咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等样本，经洗涤、离心等处理后获得的模板进行PCR扩增检测，具有时间短、灵敏度特异性高等优点，但对操作人员要求高，且样品易污染，仪器设备昂贵，限制了其进一步应用。目前临床主要采用日本研制的凝集试验，主要原理是利用明胶粒子和提取的MP抗原结合，对患者血清中MP特异抗体的进行检测。该方法简单实用，但无法区分IgM、IgG抗体。实事上，IgM抗体出现要早于IgG抗体，是MP急性感染的重要标记物。尽管目前存在针对IgM-ELISA试剂盒，但由于缺少对MP抗原表位的深入研究，试剂盒灵敏度特异性差，难以达到临床检测的标准。MP基因组为双链环状DNA，全长816394bp，编码上百种蛋白。黏附是MP致病和感染的先决条件，引发这一过程的是MP顶端的“黏附蛋白复合体”介导，其中黏附蛋白Pl除了在MP感染和致病过程中发挥重要的作用外，还是重要的免疫原。刺激机体产生强烈的免疫应答、具有很好的免疫原和抗原性，是诊断抗原研究的重要靶点。Pl蛋白由1627个氨基酸组成，相对分子量约为176. 8kD。Chaudhry针对Pl抗原表位的研究显示位于C末端的1160-1521aa具有较好的免疫反应性，能与72. 7% (24/33)的阳性血清发生反应，与32份阴性血清的特异性为100% ;而位于N末端的60-180aa并没有抗原活性。针对Pl蛋白C末端的抗原表位进行生物信息学预测，筛选并表达了 1154-1521aa区段抗原，灵敏度和特异性分别为55.6% (20/36)和100% (45/45)，但对Pl蛋白N端及中间部位的抗原表位情况并不清楚。不同于其他病原体，MP采用不同于独特的偏性密码子系统，通用的终止密码子UGA在MP中编码色氨酸，如果直接采用MP的野生基因能造成蛋白翻译的中断，限制了重组MP抗原的研制。目前重组MP抗原的克隆表达通常规避UGA，获得的多为不含色氨酸的片段抗原，缺少对抗原表位有效的预测和筛选，或是直接采用灭活的全菌体提取抗原，直接影响后期MP检测试剂的研制。
技术实现思路
为了获得具有诊断意义的重组MP抗原，本专利技术针对MP黏附蛋白Pl的报道较少的90-1099aa抗原区间进行生物信息学表位预测，获得其中可能与患者血清发生免疫反应的抗原片段的氨基酸序列。为了克服野生MP基因密码子偏性的问题，本专利技术采用大肠杆菌优势密码子反向翻译上述抗原的氨基酸序列，获得由大肠杆菌优势密码子组成的全新MP抗原基因，其基因序列如序列表中序列1-6所示，并采用退火延伸PCR技术获得改造后的MP基因。采用基因重组技术对上述MP基因进行克隆表达，获得高表达的MP抗原，以此重组抗原为基础建立IgM捕获法MP-ELISA检测试剂，并评价其MP检测中的诊断意义。本专利技术的目的是提供肺炎支原体Pl黏附蛋白90-1099aa区间抗原表位的位置。本专利技术另一目的提供有大肠杆菌优势密码子组成的上述抗原表位基因本专利技术提供了在上述基因基础获得的MP重组抗原及其抗原组合物。本专利技术还提供了在上述抗原及其组合物基础上建立的肺炎支原体Pl-1gM抗体检测试剂盒，该试剂盒实现了在肺炎支原体感染早期进行准确检验的目的。具体地，本专利技术提供一种肺炎支原体抗原，其特征在于所述抗原片段为MP371或MP661，所述MP371抗原为MP黏附蛋白Pl的N末端抗原，其位点位于371_480aa ;所述1^661抗原为MP黏附蛋白Pl的N末端抗原，其位点位于661-772aa。进一步，所述MP371抗 原结构为SEQID NO :3所示，所述MP661抗原结构为SEQ IDNO -A所示。本专利技术提供一种肺炎支原体抗原的密码子优化基因，所述MP371抗原核苷酸序列如列表SEQ ID NO 9所示；所述MP661抗原核苷酸序列如列表SEQ IDNO 10所示。本专利技术还提供了一种上述密码子优化基因在制备检测肺炎支原体的药物中的应用，以及所述MP371抗原与MP661抗原在制备检测肺炎支原体药物中的组合应用。本专利技术还提供一种肺炎支原体抗原组合物，该组合物中含有上述MP371抗原片段和MP661抗原片段。进一步，所述MP371抗原C末端与所述MP661抗原N末端连接。本专利技术还提供一种检测肺炎支原体的试剂盒，所述试剂盒上述任一种优化基因或上述的组合物。进一步，所述检测是利用IgM抗体捕获法进行。本专利技术还提供一种上述试剂盒在检测肺炎支原体IgM抗体中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下特点1.专利技术是建立对肺炎支原体Pl(90_1099aa)区间抗原表位分析的基础上P1是MP介导黏附和感染的重要蛋白，也是能引起机体免疫反应的重要抗原，但目前针对Pl表位的研究多集中在其C末端，其他区域(90-1099aa)的抗原表位分布情况并不清楚。本研究采用生物信息学对上述区间表位及其活性进行系统分析，并利用MP肝炎血清验证筛选抗原的活性，从而获其中具有诊断意义的新抗原表位。2.专利技术是建立利用密码子优化技术获得的肺炎支原体重组抗原的基础上目前肺炎支原体检测试剂共采用两类抗原，一类是从灭活的MP全菌体中提取的抗原，含有多种膜抗原成分，灵敏度高，但特异性差，且病原灭活过程中生物安全性差；另一类是通过常规基因工程技术获得肺炎支原体重组抗原，由于野生型的肺炎支原体采用的是偏性密码子，按此方法获得重组抗原均在色氨酸处中断，难以获得完整抗原，致使抗原灵敏度低；本专利技术利用密码子优化技术，获得不含有偏性密码子的MP优化基因，实现MP完整抗原的重组表达，克服目前常用抗原的缺陷。3.本专利技术是在IgM捕获法基础上实现对EV71的临床诊断目前报道的MP抗原由于受到提取方式、表达量及后续抗原标记过程的限制，均是采用MP抗原包被，抗IgM抗体标记辣根酶显色的间接ELISA检测技术，本研究将利用抗μ链单抗包被酶联板，以辣根酶标记重组VPl抗原，建立IgM捕获法MP-ELISA检测技术，与间接ELISA技术相比，具有较高的特异性。附图说明图1为MP-Pl抗原表位的预测； 图2为MP-Pl主要抗原表位的基因的获得。具体实施例方式以下结合附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。为实现上述目的，本专利技术根据肺炎支原体Pl氨基酸序列，采用生物信息学技术预测Pl(本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肺炎支原体抗原，其特征在于：所述抗原片段为MP371或MP661，所述MP371抗原为MP黏附蛋白P1的N末端抗原，其位点位于371?480aa；所述MP661抗原为MP黏附蛋白P1的N末端抗原，其位点位于661?772aa。
【技术特征摘要】
1.一种肺炎支原体抗原，其特征在于所述抗原片段为MP371或MP661，所述MP371抗原为MP黏附蛋白Pl的N末端抗原，其位点位于371-480aa ;所述MP661抗原为MP黏附蛋白Pl的N末端抗原，其位点位于661-772aa。2.根据权利要求1所述的肺炎支原体抗原，其特征在于所述MP371抗原结构为SEQID NO 3所示，所述MP661抗原结构为SEQ ID NO 4所示。3.权利要求1或2所述抗原的密码子优化基因，其特征在于所述MP371抗原核苷酸序列如列表SEQ ID NO 9所示；所述MP661抗原核苷酸序列如列表SEQ ID NO 10所示。4.权利要求1所述抗原或权利要求3所述密码子优...
【专利技术属性】
技术研发人员：张贺秋，修冰水，陈堃，张奇舒，冯晓燕，杨锡琴，李鹏飞，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：
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