本发明专利技术提供了一种用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法，该方法采用具体步骤是：（1）量子点标记蛋白液的制备，（2）量子点标记蛋白检测液的制备，（3）制备包被有检测指标的反应膜，（4）在上述PVC背衬上顺序粘贴样品垫、步骤（3）制得的反应膜以及吸水垫，得到试纸板，将试纸板切割成试纸条，将试纸条装载于试纸卡内，（5）定性或定量检测。这种用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法是一种高灵敏度、多指标同时检测、简便、直观、价格低廉、应用广泛的量子点荧光免疫层析试纸条快速检测方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及ー种用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法，属于免疫检测领域。
技术介绍
免疫层析试纸条检测也称为免疫侧向层祈，是ー种快速、简便、灵敏、直观、价格低廉，并可进行现场检测的方法。具有放射性免疫、酶联免疫吸附法、气相色谱法、液相色谱法、毛细管电泳等仪器检测方法所不具备的优点，在检测技术中处于重要地位，是对传统和大型仪器检测方法的有力补充。随着社会的发展，人类对生活质量有了更高的要求，免疫层析检测技术在面对人类疾病、环境污染物、食品安全、动物医学等重大问题时具有重要的作用。当前免疫层析产品主要是基于胶体金技术而开发的，在医学检验、毒品检测、食品安全检测等领域得到了广泛的应用。但该技术由于存在颗粒粒径均一性差、免疫标记物不稳定、顔色単一只能单指标检测、无法实现准确定量检测、灵敏度不高等不足，无法满足人们的需求。因此专利技术高灵敏度、多指标同时检测、简便、直观、价格低廉的免疫层析检测方法十分必要。量子点是ー种在光源激发下发射出明亮荧光的半导体纳米晶粒。具有以下特点1、粒径不同，发光颜色不同，并且可以用单一光源激发多种不同顔色的量子点；2、量子点的发射谱狭窄对称，同时激发的多种量子点不易出现重叠，使多重分子同时检测容易实现；3、量子点的量子产率高、荧光强，可以接受长时间反复激发，光化学稳定性好，不易猝灭。 由于量子点具有以上优良特性，使其可能成为分子检测和医学诊断的有力工具，经过近20多年的发展,逐步从细胞、组织标记成像、细胞示踪、活体成像等应用研究开始向临床检测、疾病控制、食品安全检测等领域方向发展。但目前各种现有的涉及量子点的免疫层析试纸条检测方法，或者由于选用的为核型量子点、水相合成的量子点或者量子点包裹微球等，或者由于采取固化方法将其固定在结合区，而影响了检测灵敏度的提高并造成精密度差。
技术实现思路
为克服现有技术中的不足，本专利技术提供了ー种用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法，该方法是ー种高灵敏度、多指标同时检测、简便、直观、价格低廉、应用广泛的量子点荧光免疫层析试纸条快速检测方法。实现上述目的的技术方案为ー种用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法，具体采用如下步骤(I).量子点标记蛋白液的制备取浓度为11^-101^的0.2-21111101羧基水溶性CdSe/ZnS量子点平衡至室温，并用超声波处理；将量子点、EDC、蛋白均用20mlT200mM、pH6. (T7. 4的磷酸盐溶液或硼酸盐溶液溶解；按照I U mo广5 u mo I EDC/2nmol量子点的比例加入EDC,EDC即碳ニ亚胺盐酸盐,润旋振荡混勻，再按InmoflOOnmol蛋白/Inmol量子点的比例加入浓度为f 10mg/mL的蛋白，涡旋混匀，室温搅拌反应1-4小时；反应结束后用截留分子量为IOkDa-1OOkDa的离心超滤管超滤浓缩至20-100 y L，然后采取凝胶尺寸排阻色谱法进行纯化，收集有荧光的部分，再用离心超滤管浓缩至量子点浓度为0. 2-2 u mol/L,保存于lOmM-lOOmM、pH为7. 4^9. 0的、含有质量百分比浓度为0. 05%的NaN3的硼酸盐缓冲液中，2 8°C冰箱保存备用；(2).量子点标记蛋白检测液的制备将上述量子点标记蛋白液取出放置至室温，用PBS-TBN稀释100-1000倍成量子点标记蛋白检测液，PBS-TBN为含20mM-150mM氯化钠NaCUO. 02%-0. 1% 吐温Tween-20、2mg/mL-10m/mL 牛血清白蛋白 BSA、0. 05% 叠氮化钠 NaN3的IOmM-1OOmM磷酸盐缓冲液PB，然后置于2 8°C冰箱保存备用；(3).制备包被有检测指标的反应膜检测指标为抗体或抗原，以硝酸纤维素膜为反应膜，将反应膜固定粘贴在PVC背衬的中间部位，将抗原或抗体用包被缓冲液调节浓度至0.1 5mg/mL,并将ニ抗IgG用包被缓冲也调节浓度至0.1 5mg/mL,按照0. 8 1. 2uL/cm的膜液量，将抗原或抗体，以及ニ抗IgG喷到反应膜上对应的检测区和控制区上进行包被，检测区和控制区之间间隔为3 7mm，放置25 37°C烘箱处理1_3小时，置于恒温恒湿保藏箱里备用，所用包被缓冲液为含有20mM-150mM氯化钠NaCl、0. 05%_3%聚こニ醇PEG20000、0. 2%-1% 海藻糖、2mg/mL-10m/mL 牛血清白蛋白 BSA、0. 05% 叠氮化钠 NaN3 的 IOmM-1OOmM磷酸盐缓冲液PB ；(4).在上述PVC背衬上顺序粘贴样品垫、步骤(3)制得的反应膜以及吸水垫，得到试纸板，将试纸板切割成试纸条，将试纸条装载于试纸卡内，得量子点荧光免疫层析试纸条;(5).定性或定量检测取300uL-500iiL量子点标记蛋白检测液与IOiiL-50 u L待检测样本充分混匀后，取60 u L-100 u L混合液加入到试纸卡上的加样孔内，反应3-15min即可读取结果； (5.1)定性检测或半定量检测采用紫外灯照射加样反应后的反应膜区域，通过肉眼观察条带发光情况，如果体系为检测大分子物质的双抗夹心法，当检测线出现荧光信号时判定该指标为阳性；不出现荧光信号则为阴性；如果检测体系为检测小分子物质的竞争法，则结果相反，出现荧光信号的检测线报告为阴性，未出现荧光信号报告为阳性；无论采取哪种方法，如果控制线没有荧光信号则检测结果无效；(5. 2)定量检测配备一系列不同浓度的待检分子标准溶液，然后利用荧光定量分析仪分别进行免疫层析检测，通过对每个峰面积对应浓度做标准曲线，再将待检未知样品进行同样处理，得到峰面积，根据标准曲线公式得知样品中待测分子含量。由上述技术方案可知，本专利技术所述的量子点荧光免疫层析试纸条检测法与放射性免疫、酶联免疫吸附法、气相色谱法、液相色谱法、毛细管电泳等方法相比，具有操作安全(无放射污染源)、简便(步骤少，操作简单)和快速(3-15min即可出結果)等优点；与胶体金免疫层析法试纸条相比，本专利技术标记稳定性好(生物分子与量子点共价结合)、多指标同时检测(不同粒径量子点其荧光发射波长不同，可实现多指标同时检测)、灵敏度高(量子点的荧光强度高，可实现对低丰度靶分子的检测)、定性定量皆可等优点。本专利技术所述的量子点荧光免疫层析试纸条检测法，具体可以用双抗体或抗原夹心法(待检分子为大分子物质，免疫结合位点多)、免疫竞争法(待检分子为小分子，免疫结合位点少)等检测分析方法，应用领域广，可用于单项指标或者多指标的高灵敏快速检测，能够检测全血、血清、血浆、唾液、尿液、食品等样本；能用于人类疾病诊断、病原微生物检出、环境污染物检测、毒品检测、食品有毒残留物检测等领域。附图说明图1为实施例1、2的量子点突光免疫层析检测示意图。图2为实施例3的量子点荧光免疫层析多组分检测示意图。图中1、样品垫，2、背村，3、检测区，3-1、检测区A，3-2、检测区B，4、控制区，5、反应膜，6、吸水垫，7、量子点标记蛋白与样品混合物。具体实施例方式实施例1 :诊断超敏C-反应蛋白量子点标记蛋白检测液的制备采用的羧基水溶性量子点为羧基水溶性核壳型量子点，量子点的发射波长范围是500nm-630nm，在激发光源辐射作用下能够发射不同波长的荧光，其荧光量子产率不低于 45%。取浓度本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法，其特征是至少采用如下步骤：（1）.?量子点标记蛋白液的制备：取浓度为1μM?10μM的0.2?2nmol羧基水溶性CdSe/ZnS量子点平衡至室温，并用超声波处理；将量子点、EDC、蛋白均用20mM~200mM?、pH6.0~7.4的磷酸盐溶液或硼酸盐溶液溶解；按照1μmol~5μmol?EDC/2nmol量子点的比例加入EDC，EDC即碳二亚胺盐酸盐，涡旋振荡混匀，再按1nmol~100nmol?蛋白/1nmol量子点的比例加入浓度为1~10mg/mL的蛋白，涡旋混匀，室温搅拌反应1?4小时；反应结束后用截留分子量为10kDa?100kDa的离心超滤管超滤浓缩至20?100μL，然后采取凝胶尺寸排阻色谱法进行纯化，收集有荧光的部分，再用离心超滤管浓缩至量子点浓度为0.2?2μmol/L，保存于10mM?100mM、?pH为7.4~9.0的、含有质量百分比浓度为0.05%的NaN3的硼酸盐缓冲液中，2~8℃冰箱保存备用；（2）.?量子点标记蛋白检测液的制备：将上述量子点标记蛋白液取出放置至室温，用PBS?TBN稀释100?1000倍成量子点标记蛋白检测液，PBS?TBN为含20mM?150mM氯化钠NaCl、0.02%?0.1%?吐温Tween?20、2mg/mL?10m/mL?牛血清白蛋白BSA、0.05%?叠氮化钠NaN3的10mM?100mM磷酸盐缓冲液PB，然后置于2~8℃冰箱保存备用；（3）.?制备包被有检测指标的反应膜：检测指标为抗体或抗原，以硝酸纤维素膜为反应膜，将反应膜固定粘贴在PVC背衬的中间部位，将抗原或抗体用包被缓冲液调节浓度至0.1~5mg/mL，并将二抗IgG用包被缓冲也调节浓度至0.1~5mg/mL，按照0.8~1.2uL/cm的膜液量，将抗原或抗体，以及二抗IgG喷到反应膜上对应的检测区和控制区上进行包被，检测区和控制区之间间隔为3~7mm，放置25~37℃烘箱处理1?3小时，置于恒温恒湿保藏箱里备用，所用包被缓冲液为含有20mM?150mM氯化钠NaCl、0.05%?3%?聚乙二醇PEG20000、0.2%?1%?海藻糖、2mg/mL?10m/mL?牛血清白蛋白BSA、0.05%?叠氮化钠NaN3的10mM?100mM磷酸盐缓冲液PB；（4）.?在上述PVC背衬上顺序粘贴样品垫、步骤（3）制得的反应膜以及吸水垫， 得到试纸板，将试纸板切割成试纸条，将试纸条装载于试纸卡内，得量子点荧光免疫层析试纸条；（5）.?定性或定量检测：取300uL?500μL量子点标记蛋白检测液与10μL??50μL待检测样本充分混匀后，取60μL?100μL混合液加入到试纸卡上的加样孔内，反应3?15min即可读取结果；（5.1）定性检测或半定量检测：采用紫外灯照射加样反应后的反应膜区域，通过肉眼观察条带发光情况，如果体系为检测大分子物质的双抗夹心法，当检测线出现荧光信号时判定该指标为阳性；不出现荧光信号则为阴性；如果检测体系为检测小分子物质的竞争法，则结果相反，出现荧光信号的检测线报告为阴性，未出现荧光信号报告为阳性；无论采取哪种方法，如果控制线没有荧光信号则检测结果无效；（5.2）定量检测：配备一系列不同浓度的待检分子标准溶液，然后利用荧光定量分析仪分别进行免疫层析检测，通过对每个峰面积对应浓度做标准曲线，再将待检未知样品进行同样处理，得到峰面积，根据标准曲线公式得知样品中待测分子含量。...
【技术特征摘要】
1.一种用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法，其特征是至少采用如下步骤 (1).量子点标记蛋白液的制备取浓度为Iμ M-1O μ M的O. 2-2nmol羧基水溶性CdSe/ZnS量子点平衡至室温，并用超声波处理；将量子点、EDC、蛋白均用20mlT200mM、ρΗ6. (Γ7· 4的磷酸盐溶液或硼酸盐溶液溶解；按照I μ mo广5 μ mo I EDC/2nmol量子点的比例加入EDC, EDC即碳二亚胺盐酸盐,润旋振荡混勻，再按InmoflOOnmol蛋白/Inmol量子点的比例加入浓度为f 10mg/mL的蛋白，涡旋混匀，室温搅拌反应1_4小时；反应结束后用截留分子量为IOkDa-1OOkDa的离心超滤管超滤浓缩至20-100 μ L，然后采取凝胶尺寸排阻色谱法进行纯化，收集有荧光的部分，再用离心超滤管浓缩至量子点浓度为O. 2-2 μ mol/L,保存于lOmM-lOOmM、pH为7. 4 9. O的、含有质量百分比浓度为O. 05%的NaN3的硼酸盐缓冲液中，2 8°C冰箱保存备用； (2).量子点标记蛋白检测液的制备将上述量子点标记蛋白液取出放置至室温，用PBS-TBN稀释100-1000倍成量子点标记蛋白检测液，PBS-TBN为含20mM_150mM氯化钠NaCl、0. 02%-0· 1% 吐温Tween-20、2mg/mL-10m/mL 牛血清白蛋白 BSA、0. 05% 叠氮化钠NaN3的IOmM-1OOmM磷酸盐缓冲液PB，然后置于2 8°C冰箱保存备用； (3).制备包被有检测指标的反应膜检测指标为抗体或抗原，以硝酸纤维素膜为反应膜，将反应膜固定粘贴在PVC背衬的中间部位，将抗原或抗体用包被缓冲液调节浓度至0.1 5mg/mL,并将二抗IgG用包被缓冲也调节浓度至0.1 5mg/mL,按照0. 8 1. 2uL/cm的膜液量，将抗原或抗体，以及二抗IgG喷到反应膜上对应的检测区和控制区上进行包被，检测区和控制区之间间隔为3 7mm，放置25 37°C烘箱处理1_3小时，置于恒温恒湿保藏箱里备用，所用包被缓冲液为含有20mM-150mM氯化钠NaCl、0. 05%_3%聚...
【专利技术属性】
技术研发人员：彭俊，朱小波，庞代文，张志凌，余慧，
申请(专利权)人：武汉珈源生物医学工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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