本发明专利技术涉及一种荧光定量RT-PCR检测人类免疫缺陷病毒1型的试剂盒，特别是涉及以一步法实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术快速、定量检测人类免疫缺陷病毒1型感染的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明专利技术的试剂盒实现对血清或血浆样本中人类免疫缺陷病毒1型核酸RNA进行定量检测，适用于人类免疫缺陷病毒1型感染的辅助诊断和人类免疫缺陷病毒1型感染者药物治疗的疗效监测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种荧光定量RT-PCR检测人类免疫缺陷病毒I型的试剂盒，特别是涉及以一步法实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术快速、定量检测人类免疫缺陷病毒I型感染的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本专利技术的试剂盒实现对血清或血浆样本中人类免疫缺陷病毒I型核酸RNA进行定量检测，适用于人类免疫缺陷病毒I型感染的辅助诊断和人类免疫缺陷病毒I型感染者药物治疗的疗效监测。
技术介绍
人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)是获得性免疫缺陷综合症(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)的病原体。HIV 是 1983 年法国巴斯德研究所Montagnier等首次从一例慢性淋巴结肿大的男性同性恋病人的血液中分离得到的一株新逆转录病毒。次年，美国Gallo等也从AIDS患者体内分离得到相似的逆转录病毒，根据分子病毒学研究分析证明，二者是同一病毒的不同变种。1986年，国际病毒分类委员会将他们命名为HIV。HIV主要有两型，包括HIV-1和HIV-2。两型病毒的核苷酸序列相差超过40%。全世界的AIDS大多由HIV-1所引起，HIV-1起源于中非，以后扩散到地中海、欧美及亚洲地区，而HIV-2只在西非呈地区性流行。目前艾滋病已成为威胁全球，尤其是亚洲和非洲等广大发展中国家人民生命健康安全的主要疾病之一。因此，早期检测出HIV的感染对相关疾病的治疗和预后有着重要的意义。HIV病毒株呈球形，直径约100_120nm，电镜下病毒内部有一致密的圆柱状核心。病毒外层为脂蛋白包膜，其中镶嵌有gpl20和gp41两种病毒特异的糖蛋白。病毒内层为20面体对称的核衣壳，由病毒结构蛋白组成。病毒核心含有病毒RNA，逆转录酶和核衣壳蛋白。HIV的基因结构与其它逆转录病毒基本相同，为RNA双分子，由2条相同的正股RNA链在5’端通过部分碱基互补配对而 形成双聚体。病毒基因组由9749个核苷酸组成，含有3组共9个基因(gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpu和vpr)。在病毒基因组的5，端和3，端各有一段相同的核苷酸序列，成为长末端重复序列(long terminal repeat, LTR),含有起始子、增强子、TATA序列，以及多个与病毒及细胞调节蛋白反应的区域，对病毒基因组转录的调控起关键作用。联合国艾滋病规划署公布的《2008年全球艾滋病流行状况报告》显示，2008年全球大约有3340万艾滋病病毒感染者，270万新发感染者，200万人死于艾滋病。其中，大约有43万新生儿感染艾滋病病毒，15岁以下儿童艾滋病病毒感染者的总数达到210万；年轻人占所有成年人(15岁以上)新发感染的40%。即使是随着医学技术等发展使艾滋病传播得到有效控制，但目前该病尚无法治愈，也无有效疫苗。艾滋病的广泛流行，主要是由HIV病毒引起的。因此，HIV感染的实验室诊断是艾滋病预防控制工作的重要组成部分，只有发现传染源才能更有效地控制艾滋病传播。艾滋病能通过血液、精液和宫颈分泌物传播，其他体液如唾液、脑脊液、泪液、尿液、乳汁中曾分离到HIV，但不是主要的传播途径。典型AIDS病程一般1. 5 2. 5年，发烧、疲劳、淋巴结肿大、持续腹泻、咳嗽、气短、皮疹、淤血斑、中枢神经系统疾病，各种感染，包括寄生虫病、细菌、深部真菌、病毒。AIDS患者由于免疫功能缺陷而发生肿瘤、如卡波剂氏肉瘤、淋巴瘤等。HIV感染后经5年有10%发展成AIDS，30%为AIDS相关综合征，60 %为无症状带毒者，这给AIDS的预防带来困难，估计感染后10年有50%发展为AIDS，该病在5年内死亡率均在90%，多在临床症状出现后2年之内死亡。HIV感染的病毒学诊断技术一般包括病毒分尚和病毒成份(如抗原、核酸)的检测。早期对HIV的诊断主要是通过血清学试验检测抗HIV的抗体，间接地诊断HIV感染，目前国外用于HIV抗体筛查的方法很多，根据检测原理不同分为酶联免疫吸附法、凝集法和层析法，可对血液、唾液和尿液标本进行常规或快速检测。在实际工作中常用的有酶联免疫吸附试验(ELISA)、明胶凝集试验和各种快速诊断试剂。近几年，分子生物学方法不断被应用到HIV的检测中，HIV的实验室诊断方法取得了很大的进展，HIV核酸定性检测可用于HIV感染的辅助诊断，如窗口期辅助诊断、病程监控、指导治疗方案及疗效测定、预测疾病进程等。核酸检测已经成为了 HIV实验室诊断的发展方向。实时荧光PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有核电偶联装置(CCD)的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。一步法实时荧光RT-PCR技术是实时突光 PCR 的一种(Yuqi Z, Min Y, Johann WM, et al. 2002. Quantification ofHuman Immunodeficiency Virus Type IProviral DNA by Using TaqMan Technology. JCli Microbiol. 40(2) :675-678 ；Drosten C, Seifried E, Roth WK, et al. 2001，TaqMan5_-nuclease human immunodeficiency virus type I PCR assay with phage-packagedcompetitive internal control for high-throughput blood donor screening.JClin Microbiol, 39 :4302-4308 ；Schuurman R, Descamps D, Weverling GJ, et al. 1996，Multicenter comparison of three commercial methods for quantification of humanimmunodeficiency virus type I RNA in plasma. J Clin Microbiol, 34 :3016-3022 ;Christopherson C,Kidane Y,Conway B et al. 2000. PCR-based assay to quantify humanimmunodeficiency virus type I DNA in peripheral blood mononuclear cells. J ClinMicrobiol, 38 :630-634.)，它是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处在于前者在反应体系中增加了逆转录酶，同时多了一个逆转录反应步骤；相同之处在于两者在反应体系中均有一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针，探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种荧光定量RT?PCR检测人类免疫缺陷病毒1型的试剂盒，试剂盒包括：(1)核酸提取试剂、HIV?1反应液A、HIV?1反应液B、HIV?1反应液C、HIV?1内标溶液、阴性质控品、HIV?1强阳性质控品、HIV?1临界阳性质控品、HIV?1阳性定量参考品1?4，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中PCR反应体系包括HIV?1反应液A、HIV?1反应液B和HIV?1反应液C，其特征在于HIV?1反应液A(引物探针混合液)中用于靶多核苷酸扩增的正向和反向引物分别是：5’?ATGGCAGTATTCATYCACAATT?3’(SEQ?ID?NO：1)5’?ATTATGTCTAYTATTCTTTCYCCTG?3’(SEQ?ID?NO：2)用于靶多核苷酸扩增的寡核苷酸探针是5’?X?ACTGTAYCCCCCAATCCCCCCTT?Y?3’(SEQ?ID?NO：3)，其中X/Y表示荧光标记基团，包括能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针；用于内标多核苷酸扩增的寡核苷酸探针是5’?X?TGACGGACCACACTGACCAGAG?Y?3’(SEQ?ID?NO：4)，其中X/Y表示荧光标记基团。...
【技术特征摘要】
1.一种荧光定量RT-PCR检测人类免疫缺陷病毒I型的试剂盒，试剂盒包括(1)核酸提取试剂、HIV-1反应液A、HIV-1反应液B、HIV-1反应液C、HIV-1内标溶液、阴性质控品、HIV-1强阳性质控品、HIV-1临界阳性质控品、HIV-1阳性定量参考品1_4，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中PCR反应体系包括HIV-1反应液A、HIV-1反应液B和HIV-1反应液C，其特征在于HIV-1反应液A(引物探针混合液)中用于靶多核苷酸扩增的正向和反向引物分别是5’-ATGGCAGTATTCATYCACAATT-3’ (SEQ ID NO:1)5’-ATTATGTCTAYTATTCTTTCYCCTG-3’ (SEQ ID NO 2) 用于靶多核苷酸扩增的寡核苷酸探针是5’ -X-ACTGTAYCCCCCAATCCCCCCTT-Y-3’ (SEQID NO :3)，其中X/Y表示荧光标记基团，包括能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针； 用于内标多核苷酸扩增的寡核苷酸探针是5’ -X-TGACGGACCACACTGACCAGAG-Y-3’ (SEQID NO :4)，其中X/Y表示荧光标记基团。2.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于正、反向引物的浓度均为IOpmol/人份，目的寡核苷酸探针、内标寡核苷酸探针的浓度均为5pmol/人份。3.根据权利要求1的试剂盒，HIV-1反应液B由逆转录酶(c-...
【专利技术属性】
技术研发人员：李明，丁渭，陈华云，
申请(专利权)人：中山大学达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。