本发明专利技术属于微藻生物技术领域，特别涉及一种利用植物激素和铁离子诱导小球藻合成虾青素的方法。具体为将小球藻在液体培养基中活化培养，获得同步化生长的藻液，待用；取上述生长到处于指数生长期的藻液，并向藻液中添加植物激素和铁离子，同时补充碳源和氮源进行培养，直至藻体细胞内虾青素的积累量最高时培养结束(取样采用液相色谱法测定虾青素积累量)，采收细胞破壁提取虾青素。本发明专利技术简单易行、成本低廉、能显著增加虾青素的产量，从而大大提高小球藻生产虾青素的效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微藻生物
，特别涉及一种。
技术介绍
虾青素(Astaxanthin)是一种鲜红色脂溶性色素，属于酮式类胡萝卜素。大量实验表明，虾青素不但具有独特的着色功能，而且还表现出超强的抗氧化特性和多种生物活性。由于突出的生理功能，虾青素在水产及家禽养殖、食品、化妆品、医药等领域具有广阔的应用前景，因此几十年来利用各种途径生产虾青素一直是国内外普遍关注的热点问题。目前虾青素的规模化生产主要依靠化学手段人工合成，或是从甲壳类动物及其加工后的废物、红法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous,即以前的Phaffia rhodozyma)及雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)中提取生物合成的天然奸青素。由于生产技术难度高及菌种和藻种本身的限制，虾青素的产量有限，远远不能满足市场需求， 这也在一定程度上制约了天然虾青素的广泛应用。小球藻Chlorella zofingiensis合成奸青素的能力自二十世纪90年代报道后引起了广泛关注，被认为有可能成为新的天然虾青素工业来源。1994年，Rise等首次报道了 C. zofingiensis在高光和氮缺乏的协同作用下,能够在胞内大量合成并积累奸青素,用以抵御光氧化损伤。随后，C. zofingiensis的奸青素合成模式、合成途径、及其合成途径上关键基因的表达调控机制陆续被报道出来。2005年，Ip和Chen首次发现了光照不是诱导C. zofingiensis奸青素积累的必要条件,在黑暗条件下C. zofingiensis仍然能以较快的速度合成奸青素，提出了暗异养培养C. zofingiensis生产奸青素的概念,并申请了美国专利(US2005214897-A1)。上述研究进展暗示,虽然小球藻C. zofingiensis和雨生红球藻 H. pluvialis 一样同属单细胞绿藻,但二者的细胞生理生化特性和奸青素合成机制截然不同。因此，C. zofingiensis源奸青素的生产工艺不能照搬照抄现有的H. pluvialis源奸青素的生产模式和调控技术，必须专门针对C. zofingiensis细胞特性及其奸青素代谢调控机制建立一套新的工艺流程和设备，这是C. zofingiensis源奸青素产业化生产前必须首先完成的任务。
技术实现思路
本专利技术提供一种。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为一种(I)活化培养将小球藻(Chlorella zofingiensis)在液体培养基中活化培养, 获得同步化生长的藻液，待用；(2)诱导培养取步骤(1)中生长到处于指数生长期的藻液，并向藻液中添加植物激素和铁离子，同时补充碳源和氮源进行培养，直至 藻体细胞内虾青素的积累量最高时培养结束(取样采用液相色谱法测定虾青素积累量)，收集菌株细胞破壁提取虾青素。所述活化培养是将小球藻(C. zofingiensis)培养于液体培养基中振荡发酵养，培养条件为温度20-30°C，光强0-200 μ mol πΓΥ1，转速100_200rpm，光暗比为 12-24h/12-24h。所述液体培养基为 Kuhl.BG-lUBBM, Basal、CZ-M1、KMl 中的一种。所述 Kuhl培养基为10g/L葡萄糖、lg/L硝酸钾、89mg/L十二水磷酸氢二钠、621mg/L 二水磷酸二氢钠、246mg/L七水硫酸镁、9. 3mg/L EDTA、6. 9mg/L七水硫酸亚铁、14. 7mg/L 二水氯化钙、O. 29mg/L七水硫酸锌、O. 17mg/L 一水硫酸锰、O. 06mg/L硼酸、O. 002mg/L五水硫酸铜、 O. 012mg/L 四水钥酸铵、1000ml 水，pH 6. 5。所述诱导培养为取步骤(I)中生长到处于指数生长期的藻液，并向藻液中添加植物激素和铁离子，同时补充碳源和氮源进行振荡发酵养培养，培养条件为温度20-30°C，光强0-200 μ mol HT2s-1,转速100-200rpm，光暗比为12_24h/12_24h ;直至藻体细胞内虾青素的积累量最高时培养结束(取样采用液相色谱法测定虾青素积累量)，采收细胞破壁提取虾青素。所述植物激素为茉莉酸甲酯、茉莉酸、油菜素内酯中的一种或几种；并且其一次性添加或流加，流加量控制在O. 1-1. OrnM。所述铁离子为亚铁或三价铁；并且其一次性添加或流加，流加量控制在O. 02-20mM。所述碳源为无机碳源和/或有机碳源；所述氮源为无机氮源和/或有机氮源；并且其一次性添加或流加，碳源和氮源添加量控制在C/N比100-300。 所述无机碳源为二氧化碳、碳酸盐、碳酸氢盐中的一种或几种；所述有机碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油、乙醇、醋酸盐中的一种或几种。所述无机氮源为硝酸盐、铵盐、氨水中的一种或几种；所述有机氮源为尿素、酵母粉、蛋白胨中的一种或几种。本专利技术所具有的优点本专利技术基于对小球藻C. zofingiensis中虾青素合成代谢调控的研究，筛选出了虾青素合成的有效促进剂(植物激素和铁离子复合制剂)，实现了小球藻虾青素的快速合成和高效积累。本专利技术通过在细胞生长的指数期添加虾青素合成促进剂(植物激素和铁离子)， 同时适当补充碳源和氮源，在避免了这些物质过早加入对藻细胞生长的抑制作用的同时， 大幅提高了虾青素的产量，是对照组的1. 5-7. 5倍。从中提取的虾青素可用于水产及家禽养殖、食品、化妆品、医药等领域。本专利技术采用廉价原料，操作简单，具有很高的推广应用价值。具体实施方式实施例1I)活化培养无菌条件下挑取小球藻C. zofingiensis单藻落到灭菌的Kuhl液体培养基中，而后将藻种按10% (体积比)接种量，接种到含IOOml无菌Kuhl培养基的250ml 三角瓶中，在温度为25 □ C,转速为150rpm,光照强度为IOOymol IrT2S4连续光照的摇床 中振荡培养。Kuhl培养基配方10g/L葡萄糖、lg/L硝酸钾、89mg/L十二水磷酸氢二钠、621mg/L 二水磷酸二氢钠、246mg/L七水硫酸镁、9. 3mg/L EDTA、6. 9mg/L七水硫酸亚铁、14. 7mg/L 二水氯化钙、0. 29mg/L七水硫酸锌、0. 17mg/L 一水硫酸锰、0. 06mg/L硼酸、0. 002mg/L五水硫酸铜、0. 012mg/L四水钥酸铵、1000ml水，pH 6. 5。2)诱导培养取步骤⑴培养3天后中生长到处于指数生长期的藻液，在无菌条件下，向培养液内加入茉莉酸甲酯至终浓度O.1mM,氯化亚铁至终浓度O. 2mM,葡萄糖至终浓度200mM，硝酸钾至终浓度5mM。继续培养9天后，藻细胞的生物量和虾青素产量达到最高，培养结束，取样采用液相色谱(HPLC)法测定(色谱仪采用Waters 2695自动抽气进样系统和Waters 2996紫外检测器、二极管阵列检测器(PDA);光谱扫描波长范围为 300-700nm ;积分定量用检测波长为450nm ;温度4°C;进样量20 μ I ;流速1. 2ml mirT1 ;色谱柱采用 Waters Spherisorb 0DS2 C18 反相柱(4. 6X 250mm, 5 μ m);流动相 A 采用乙腈 无水甲醇O.1M 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用植物激素和铁离子诱导小球藻合成虾青素的方法，其特征在于：(1)活化培养：将小球藻(Chlorella?zofingiensis)在液体培养基中活化培养，获得同步化生长的藻液，待用；(2)诱导培养：取步骤(1)中生长到处于指数生长期的藻液，并向藻液中添加植物激素和铁离子，同时补充碳源和氮源进行培养，直至藻体细胞内虾青素的积累量最高时培养结束(取样采用液相色谱法测定虾青素积累量)，采收细胞破壁提取虾青素。
【技术特征摘要】
1.一种利用植物激素和铁离子诱导小球藻合成虾青素的方法，其特征在于 (1)活化培养将小球藻(Chlorellazofingiensis)在液体培养基中活化培养,获得同步化生长的藻液，待用； (2)诱导培养取步骤(I)中生长到处于指数生长期的藻液，并向藻液中添加植物激素和铁离子，同时补充碳源和氮源进行培养，直至藻体细胞内虾青素的积累量最高时培养结束(取样采用液相色谱法测定虾青素积累量)，采收细胞破壁提取虾青素。2.按权利要求1所述的利用植物激素和铁离子诱导小球藻合成虾青素的方法，其特征在于所述活化培养是将小球藻(C. zof ingiensis)培养于液体培养基中振荡发酵养,培养条件为温度 20-30°C，光强 0-200 μ mol nT2s4，转速 100_200rpm，光暗比为 12_24h/12_24h。3.按权利要求1或2所述的利用植物激素和铁离子诱导小球藻合成虾青素的方法，其特征在于所述液体培养基为Kuhl、BG-11、BBM、Basal、CZ-MUKMl中的一种。4.按权利要求3所述的利用植物激素和铁离子诱导小球藻合成虾青素的方法，其特征在于所述Kuhl培养基为10g/L葡萄糖、lg/L硝酸钾、89mg/L十二水磷酸氢二钠、621mg/L二水磷酸二氢钠、246mg/L七水硫酸镁、9. 3mg/L EDTA、6. 9mg/L七水硫酸亚铁、14. 7mg/L 二水氯化钙、O. 29mg/L七水硫酸锌、O. 17mg/L 一水硫酸锰、O. 06mg/L硼酸、O. 002mg/L五水硫酸铜、O. 012mg/L四水钥酸铵、IOOOml水，pH 6. 5。5.按权利要求3所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：王艳，秦松，
申请(专利权)人：中国科学院烟台海岸带研究所，
类型：发明
国别省市：
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