本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体涉及到一种蛋白质表达质粒，该质粒能够将表达的外源蛋白展示在细胞表面，并且能够将表达的外源蛋白从细胞表面自动释放出来。该质粒在商品质粒pET20b的多克隆位点插入INP基因和Intein基因，并在Intein基因3’端构建了多克隆位点（MCS，包括Nco?I，Xba?I，EcoR?I和Xho?I）。将外源蛋白基因插入到质粒pINP-Intein多克隆位点后，获得重组表达载体；再转入大肠杆菌表达宿主，经诱导表达后，插入到质粒多克隆位点的外源蛋白基因不但能够展示在细胞表面，而且能够在Intein的剪切作用下从细胞表面释放出来。该表达质粒在蛋白质及多肽文库的筛选、酶和抗体的制备以及全细胞生物催化等方面具有潜在的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及到一种蛋白质表达质粒，该质粒能够将表达的外源蛋白展示在细胞表面，并且能够将表达的外源蛋白从细胞表面自动释放出来。
技术介绍
细胞表面展示技术是以细胞表面蛋白为运载蛋白，通过基因工程手段将外源蛋白与细胞表面蛋白进行融合表达，通过细胞表面蛋白的携带将外源蛋白展示在细菌或者酵母菌的细胞表面，从而使完整细胞具有了新的功能。自上个世纪八十年代中期第一个细菌细胞表面展示体系建立以来，细胞表面展示技术在活体疫苗、肽库筛选、抗体生产、生物吸附、 全细胞催化、生物传感器和酶定向进化等生物领域得到了广泛应用。在各种运载蛋白中， 冰核蛋白(Ice Nucleation Protein, INP)是载运能力最大的运载蛋白，运载蛋白的分子量最高可达到100kD。假单胞菌属(Pseudomonas)、黄杆菌属(Xanthomonas)和欧文氏菌属 (Erwinia)中的某些细菌，其细胞表面包含INP，在过冷条件下INP能催化水生成冰晶。研究表明，天然INP具有三个结构域，N端结构域与磷脂层的外层相互作用，C端结构域高度亲水并暴露于外膜，中间是重复序列，作为冰晶核模板起到催化作用。根据INP的结构特点， 已经构建了 INP全长展示系统、无中间重复序列展示系统以及含部分中间重复序列的展示系统。目前以INP为运载蛋白，已经成功地将金属调整蛋白(metal Ioregulatory protein, MerR)> 有机憐水解酶(organophosphate hydrolase)、羧酸酯酶 (carboxy I esterase )> 甲基对硫憐水解酶(Methyl parathion dydrolase)、纤维素酶 (cellulase)展示在大肠杆菌、根瘤菌(Rhizobium)、摩拉克氏菌(Moraxella)、假单胞菌细胞的表面。虽然这些蛋白被成功的展示在了细胞表面，发挥了它们的作用，但这些蛋白也被固定在了细胞表面，对进一步研究(如纯化、性质表征和定向进化等)和应用带来了很多限制。为了克服上述问题，我们期望能够构建一种新的细胞表面展示质粒，使展示在细胞表面的外源蛋白能够从细胞表面解离下来，从而拓展细胞表面展示技术的应用范围。蛋白内含子(Intein)又称内蛋白子，是前体蛋白质中的一段插入序列。其功能是在蛋白翻译后成熟过程中，能自动准确切除蛋白内含子及两侧蛋白外显子序列，并以正常的肽键连接形成成熟蛋白，这个过程称为蛋白剪接(protein splicing)。Intein对应的核苷酸序列嵌合在宿主蛋白对应的核酸序列之中，与宿主蛋白质基因存在于同一开放阅读框 (openreadingframe, 0RF)内，并与宿主蛋白质基因进行同步转录和翻译，当形成蛋白质前体之后， Intein从宿主蛋白质中被切除，从而形成成熟的具有活性的蛋白。蛋白内含子目前主要用于蛋白的纯化、毒性蛋白的表达、蛋白环化等方面。基于目前细胞表面展示技术存在的不足以及Intein所具有的生物学功能，本专利技术拟将这两项技术相结合，构建具有细胞表面展示并自动释放功能的蛋白质表达载体，以拓展细胞表面展示技术的应用范围。
技术实现思路
本专利技术的目的是为生物
提供一个新的细胞表面展示质粒，是在质粒 pET20b的多克隆位点插入序列如SEQ ID NO. 9所示的基因片段。该质粒既可以使插入到多克隆位点的外源蛋白展示在细胞表面，又可以在一定条件下使外源蛋白从细胞表面自动释放出来，可用于外源蛋白在大肠杆菌的分泌表达、蛋白质和酶的定向进化、全细胞的生物催化。本专利技术首先提供了一种新的细胞表面展示质粒,其特点是在商品质粒pET20b的多克隆位点插入INP基因和Intein基因，并在Intein基因3’端构建了多克隆位点(MCS， 包括Nco I，Xba IjEcoR I和Xho I)。通过分子生物学技术将外源蛋白基因插入到质粒多克隆位点后，获得重组表达载体；再将重组表达载体转入大肠杆菌表达宿主，如BL21，经诱导表达后，插入到质粒多克隆位点的外源蛋白基因不但能够展示在细胞表面，而且能够在 Intein的剪切作用下自动从细胞表面释放出来。所述的INP基因，其编码的氨基酸序列与来源于细菌Pseudomonas syringae的冰核蛋白(在GenBank中的登录号为CBI99147.1)的N端部分片段以及C端部分片段相一致， 删除了原始蛋白中的中间片段。所述的Intein基因，其编码的氨基酸序列与来源于古菌Synechocystis Sp. Pcc6803的Intein氨基酸序列(在GenBank中的登录号为ABD24064.1)的部分片段相一致，但是根据大肠杆菌密码子的偏嗜性，对Intein氨基酸所对应的密码子进行了重新编码和人工设计合成。其次，本专利技术提供了一种利用上述载体将外源蛋白展示在细胞表面并能够使目标蛋白自动从细胞表面解离下来的方法，其特点是包括以下步骤a.使用常规分子生物学技术，如酶切连接、基因重组等方法，将外源蛋白基因插入到质粒ρΙΝΡ-1ntein的多克隆位点，获得重组表达载体；b.可以使用常规的转化方法，如化学转化、电转化等，将所构建的重组表达载体转入表达宿主，如大肠杆菌B121，通过添加IPTG进行诱导表达，获得融合蛋白并被展示在细胞表面，所述融合蛋白包括所述冰核蛋白片段(INP)，所述蛋白内含子(Intein)，所述外源蛋白和所述寡聚组氨酸亲和纯化标签。c.融合蛋白中的蛋白内含子(Intein)可以自动将位于其C端的外源蛋白和寡聚组氨酸亲和纯化标签从细胞表面剪切下来，剪切下来的外源蛋白的C末端融合寡聚组氨酸亲和纯化标签，因而外源蛋白容易被浓缩纯化。所述的蛋白内含子自动剪切作用，其效率可以通过外界条件的变化而发生变化。所述的外界条件包括温度，pH值，时间以及β_巯基乙醇，所述的温度，其范围为 (20至40)°C，所述的pH范围为4. O至7. 9，所述的时间范 围为2_60小时，所述β -巯基乙醇，其浓度范围为0%至O. 1%。本专利技术的优势本专利技术提出了一种新的细胞表面展示并能使被展示的蛋白从细胞表面自动解离下来的方法，本专利技术所设计构建的表达质粒拥有如下优势I)插入到多克隆位点的外源蛋白基因经诱导后，以融合蛋白的形式展示在细胞表面；2)展示在细胞表面的外源蛋白可以自动从细胞表面解离下来，通过改变外界因素可以对外源蛋白的解离速度和效率加以控制；3)在未额外加入终止子的条件下，外源蛋白的C末端会融合表达组氨酸标签，可以方便的使用亲和层析的方法把外源蛋白纯化出来。本专利技术所提出的方法以及所设计构建的表达质粒在蛋白质及多肽文库的筛选、酶和抗体的制备以及全细胞生物催化等方面具有潜在的应用价值。附图说明图1 :本专利技术的重组质粒pET20b_INP的载体图谱；其中INP是指冰核蛋白基因， MCS是指多克隆位点，包括Nco1、Xba1、Eco I和Xho I限制性酶切位点。图2 :本专利技术图1所示重组质粒pET20b_INP的构建流程图3 :本专利技术构建的重组质粒pET20b_INP序列测定图，其中黑框标出的是目的片段部分。图4 :本专利技术的重组质粒pINP-1ntein的载体图谱，其中INP是指冰核蛋白基因， Intein是指蛋白本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蛋白质表达质粒pINP?Intein，其特征在于：是在质粒pET20b的多克隆位点插入序列如SEQ?ID?NO.9所示的基因片段，其结构如下所示，FDA00002695254100011.jpg
【技术特征摘要】
1.一种蛋白质表达质粒pINP-1ntein,其特征在于是在质粒pET20b的多克隆位点插入序列如SEQ ID NO. 9所示的基因片段，其结构如下所示，2.权利要求1所述的一种蛋白质表达质粒pINP-1ntein在将蛋白展示在细胞表面并自动释放出来方面的应用。3.如权利要求2所述的一种蛋白质表达质粒pINP-...
【专利技术属性】
技术研发人员：张作明，高文英，张红，周余来，陈彦彦，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。