本发明专利技术涉及一种于细胞内制造融合蛋白质的方法。根据本发明专利技术，提出一种融合蛋白质的制造方法，系包括下列步骤：构筑一编码一锚定区域及一第一目标胜肽的第一核酸分子；构筑一编码一黏附区域及一第二目标胜肽的第二核酸分子；递送第一核酸分子及第二核酸分子至一宿主细胞内；及培养宿主细胞，以表现一第一融合胜肽及一第二融合胜肽，且第一融合胜肽具有锚定区域及第一目标胜肽，第二融合胜肽具有黏附区域及第二目标胜肽，藉此锚定区域连接于黏附区域，以容许第一融合胜肽及第二融合胜肽相互融合。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术关于一种融合蛋白质的制造方法，且特别是攸关一种。
技术介绍
融合蛋白质(Fusion protein),是指一种连接有至少二个以上多胜肽的蛋白质，可能保有单一多胜肽原有的生物功能，或是呈现不同于单一多胜肽的生物功能。举例来说，融合有β -半乳糖苷酶(β -galactosidase)及半乳糖去氢酶(galactose dehydrogenase)的蛋白质,经细胞外实验后,证实其相较于单一酵素具有酵素动力学上的优势(请参阅 Ljungcrantz. P. , et al. , Biochem. , 1989, 28: 8786-8792)。又举例来说，融合有海藻糖磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthetase)及海藻糖磷酸脂酶(trehalose-6-phosphate phosphatase)的蛋白质,经细胞外实验后,证明其不仅保留单一酵素本身的活性外，更较单一酵素具有酵素动力学上的优势(请参阅Seo H. S.，etal. , Appl. Environ. Microbiol. , 2000, 66: 2484-2490)。再举例来说，甜菜醒去氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase)-胆喊去氧酶(chloline dehydrogenase)融合蛋白质于大肠杆菌co7i)或烟草OVicotabacum)内表现时，可以提升这些生物体抵抗逆境的能力(请参阅 Yilmaz J. L. , et al. , Biotechnol. Progs. , 2002, 18:1176-1182)。融合蛋白质可以自然存在于细胞体内，例如癌症细胞中的bcr-abl融合蛋白质。融合蛋白质也可以有目的地透过人为方式存在于细胞体内，基因工程已提供一般实验流程来实现之，如聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction, PCR)、限制酶剪切(enzymedigestion)、核酸接合(DNA ligation)、…等等。详细地说,须将二个以上各自编码一个多胜肽的基因片段连接在一起，再送入至细胞体内。接着，于细胞体内表现这些多胜肽而形成融合蛋白质。`就基因工程而言，制备融合蛋白质的方法虽然相当简单，但是融合蛋白质大多属于大分子，使得其在空间上的弹性度及自由度受到阻碍，且彼此易相互干扰而无法折迭，造成融合蛋白质失去生物活性，甚至于细胞体内形成不可溶的包涵体(inclusion body)。因此，后续须破坏细胞体取得包涵体，再从包涵体得到失活的融合蛋白质，并于适当溶液中使失活的融合蛋白质折迭而复性。但复性过程毕竟系属人为操作的，仍不比细胞体内提供的环境，因此在溶液中折迭的融合蛋白质的生物功能仍然有改善空间。
技术实现思路
自然界中，厌氧微生物演化出一种相当特殊且可以有效分解纤维素的胞器。厌氧微生物在细胞外形成纤维体(celIulosome),纤维体含有一撑架蛋白质(scaffoldingprotein),而撑架蛋白质具有一黏附区域(coherin domain),黏附区域结合至一纤维素水解酶(cellulase)的锚定区域(dockerin domain),藉此容许纤维体成为一酵素复合体(enzyme complex)而有效地分解纤维素(请参阅 Doi R. H. , et al. , Nature Rev.Microbiol. , 2004，2: 541—551)。本专利技术乃是根据黏附区域结合至锚定区域的特性，而发现二各具有黏附区域及锚定区域的融合蛋白质在同一宿主细胞中被表现，黏附区域及锚定区域不易影响此二融合蛋白质中其它多胜肽的弹性度及自由度，使得此些融合蛋白质可以于宿主细胞内折迭并相互融合，并提供此二融合蛋白质优异的生物功能。因此，在第一方面，本专利技术揭露一种融合蛋白质的制造方法，其包括下列步骤(a)构筑一编码一锚定区域及一第一目标胜肽的第一核酸分子；(b)构筑一编码一黏附区域及一第二目标胜肽的第二核酸分子；(C)递送第一核酸分子及第二核酸分子至一宿主细胞内；以及(d)培养宿主细胞，以表现一第一融合胜肽及一第二融合胜肽，且第一融合胜肽具有锚定区域及第一目标胜肽，第二融合胜肽具有黏附区域及第二目标胜肽，藉此锚定区域连接至黏附区域，以容许第一融合胜肽及第二融合胜肽相互融合。在第二方面，本专利技术揭露一种宿主细胞，其包括一第一核酸分子及一第二核酸分子，而第一核酸分子系编码一锚定区域及一第一目标胜肽，第二核酸分子系编码一黏附区域及一第二目标胜肽。附图说明图1为质体pETW-A2HCh的图谱，图中简写符号Ap，抗胺苄青霉素基因；T7promoter, T7 启动子；AHL,编码a radiobacter B11291 AHL 的基因；HDT,编码 Agrobacterium radiobacter B11291 HDT 的基因；ColEl,大肠杆菌的 ColEl 复制起始点。图2为质体pTH-ChA203的图谱，图中简写符号Km，抗康那霉素基因；T7promoter, T7 启动子;AHL，编码Agro0acten·u/α radiobacter B11291 AHL 的基因；ChBD,编妈Agrobacterium radiobacter WL-12 ChBD 的基因；pSC101,大肠杆菌的 pSClOl 复制起始点。图3为质体pTH-AL203Coh的图谱，图中简写符号Km，抗康那霉素基因；T7promoter, T7 启动子;AHL，编码Agro0acten·u/α radiobacter B11291 AHL 的基因；CohI,编妈Clostridium黏附区域的基因；pSC101,大肠杆菌的pSClOl复制起始点。图4为质体pTac-HDTDoCh的图谱，图中简写符号Ap，抗胺苄青霉素基因；TrxA，编码 TrxA 的基因；HDT,编码radiobacter B11291 HDT 的基因；Docl,编码Clostridium锚定区域的基因；ColEl,大肠杆菌的ColEl复制起始点。图5为质体pTac-TrChHDT的图谱，图中简写符号Ap，抗胺苄青霉素基因；Tac，Tac 启动子；TrxA,编码 TrxA 的基因；HDT,编码radiobacter B11291 HDT的基因；ChBD，编码circulans WL-12 ChBD的基因；ColEl，大肠杆菌的ColEl复制起始点。图6为非原态硫酸十二酯钠-聚丙烯酰胺电泳胶图，以说明重组菌株BL21 (DE3)/pETff-A2HCh生产的蛋白质分布；其中，径1:蛋 白质标准物；径2 :未经诱导的重组菌株生产的可溶性蛋白质；径3 :经诱导的重组菌株生产的可溶性蛋白质；径4 :未经诱导的重组菌株生产的不可溶性蛋白质；径5 :经诱导的重组菌株生产的不可溶性蛋白质；箭头AHL-HDT的融合蛋白质。图7为非原态硫酸十二酯钠-聚丙烯酰胺电泳胶图，以说明重组菌株BAD-5/pTH-ChA203/pTac-TrChHDTh 及 BAD-5/pTH-AL203Coh/pTac_HDTDoCh 生产的蛋白质分布；其中，径1:蛋白质标准物；径2 :经诱导的重组菌株BAD-5/pTH-ChA203/pTac本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种融合蛋白质的制造方法，系包括：（a）构筑一编码一锚定区域及一第一目标胜肽的第一核酸分子；（b）构筑一编码一黏附区域及一第二目标胜肽的第二核酸分子；（c）递送该第一核酸分子及该第二核酸分子至一宿主细胞内；以及（d）培养该宿主细胞，以表现一第一融合胜肽及一第二融合胜肽，且该第一融合胜肽具有该锚定区域及该第一目标胜肽，该第二融合胜肽具有该黏附区域及该第二目标胜肽，藉此该锚定区域连接于该黏附区域，以容许该第一融合胜肽及该第二融合胜肽相互融合。
【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白质的制造方法，系包括(a)构筑一编码一锚定区域及一第一目标胜肽的第一核酸分子；(b)构筑一编码一黏附区域及一第二目标胜肽的第二核酸分子；(c)递送该第一核酸分子及该第二核酸分子至一宿主细胞内；以及(d)培养该宿主细胞，以表现一第一融合胜肽及一第二融合胜肽，且该第一融合胜肽具有该锚定区域及该第一目标胜肽，该第二融合胜肽具有该黏附区域及该第二目标胜肽，藉此该锚定区域连接于该黏附区域，以容许该第一融合胜肽及该第二融合胜肽相互融合。2.如权利要求1所述的制造方法，其中该锚定区域系衍生自由下列微生物组成的^ 且 \Acetivibrio cellulolyticus、Bacteroides cellulosolvens、Butyrivibriofi bri sol vens、Cl os tri di um ace tobu tyli cum、Cl os tri di um cellobi oparum、Cl os tri di umcellulolyticum、Clostridium cellulovorans、Clostridium Josui Λ Clostridiumpapyrosol vens Λ Cl os tri di um thermocellum、Ruminococcus albus、Ruminococcusflavefaciens ^Neocallimas tix pa triciarum、Orpinomyces Joyoni1、Orpinomyces PC_2、Piomyces equi Λ Piomyces E2。3.如权利要求1所述的制造方法，其中该黏附区域系衍生自由下列微生物组成的^ 且 \Acetivibrio cellulolyticus、Bacteroides cellulosolvens、Butyrivibriofi bri sol vens、Cl os tri di um ace tobu tyli cum、Cl os tri di um cellobi oparum、Cl os tri di umcellulo...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵云鹏，姜中人，林莉钧，王祉雯，陈柏庭，
申请(专利权)人：逢甲大学，
类型：发明
国别省市：
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