高产叶黄素转基因小球藻及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种高产叶黄素转基因小球藻的制备方法。本发明专利技术提供了一种培育转基因小球藻的方法，为将IPP异构酶编码基因导入目的小球藻中，得到转基因小球藻，所述转基因小球藻的叶黄素产量大于所述目的小球藻；所述IPP异构酶的氨基酸序列为序列表中的序列2。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术将IPP异构酶编码基因表达盒导入野生型小球藻中，得到转基因小球藻，该转基因小球藻的叶黄素含量和野生型小球藻相比最高提高30.95%；叶黄素产量和野生型相比最高提高36.77%，为高产叶黄素小球藻。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，涉及一种。
技术介绍
叶黄素是一种含氧类胡萝卜素，其在生物体内起着十分重要的作用。叶黄素具有抗氧化活性，能够预防癌症、心血管疾病和年龄相关黄斑变性等疾病。此外，作为一种天然色素，叶黄素可作为食品、医药和保健品的色素添加剂。目前，叶黄素主要来源于万寿菊，然而由于劳动力和土地成本提高，从万寿菊获取叶黄素受到一定限制。小球藻中含有丰富的叶黄素，而且小球藻具有生长速度快、可异养培养、易于进行规模化培养和藻种改良的优点，利用小球藻合成叶黄素越来越受人们的关注。目前，应用于小球藻转基因的方法有电转化法、基因枪法、PEG-CaCl2介导的转化方法和根癌农杆菌介导转化的方法。其中，根癌农杆菌介导的转化方法具有转化方法简单、成本低，能够将大片段的DNA转入细胞的转录活性区，且以低拷贝的形式整合和重组等特点。根癌农杆菌介导转化的方法已经成功应用于小球藻Chlorella vulgaris、衣藻、雨生红球藻、杜氏盐藻、裂壶藻和微拟球藻等微藻中。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种培育转基因小球藻的方法。本专利技术提供的方法，为将IPP异构酶编码基因导入目的小球藻中，得到转基因小球藻，所述转基因小球藻的叶黄素产量大于所述目的小球藻；所述IPP异构酶的氨基酸序列为序列表中的序列2。上述方法中，所述IPP异构酶编码基因的核苷酸序列为序列表中序列I自5’末端第545-1093位核苷酸。上述方法中，所述IPP异构酶编码基因以IPP异构酶编码基因表达盒的形式导入目的小球藻；所述IPP异构酶编码基因表达盒包括CAMV35S启动子、IPP异构酶编码基因和CYCl终止子；所述IPP异构酶编码基因表达盒的核昔酸序列具体为序列表中的序列I。上述方法中，所述IPP异构酶编码基因表达盒通过重组载体导入目的小球藻；所述重组载体为将所述IPP异构酶编码基因表达盒插入表达载体中得到的载体；所述表达载体具体为PCAMBIA2301 ;所述重组载体具体为将序列表中序列I插入PCAMBIA2301载体的HindIII和BamH I酶切位点间得到的载体。上述方法中，所述重组载体通过重组农杆菌导入目的小球藻；所述重组农杆菌为将所述重组载体导入农杆菌中得到的重组菌。上述目的小球藻为小球藻STI002CGMCC No. 6951。由上述方法得到的转基因小球藻也是本专利技术保护的范围。小球藻STI002已于2012年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCCNo. 6951,建议的分类命名为 Chlorella vulgaris。本专利技术的另一个目的是提供一种重组载体。本专利技术提供的重组载体，为将IPP异构酶编码基因表达盒插入表达载体中得到的载体；所述表达载体具体为PCAMBIA2301 ；所述IPP异构酶编码基因表达盒包括CAMV35S启动子、IPP异构酶编码基因和CYCl终止子；所述IPP异构酶编码基因表达盒的核昔酸序列具体为序列表中的序列I。本专利技术的第三个目的是提供一种重组菌。本专利技术提供的重组菌，为将上述的重组载体导入农杆菌中得到的重组菌。上述的转基因小球藻、上述的重组载体或上述的重组菌在制备叶黄素中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术的第四个目的是提供一种生产叶黄素的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤I)无水乙醇超声破碎由上述方法得到的转基因小球藻或上述的转基因小球藻，再加入KOH水溶液后超声皂化，得到溶液A ；2)将所述溶液 A用二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷相，即得到叶黄素。上述方法具体如下I)无水乙醇超声破碎转基因小球藻30min ;再加入20% (质量百分含量)KOH水溶液超声皂化(超声功率70%，温度35°C ) IOmin ;得到溶液A ；2)将溶液A加入二氯甲烷和蒸馏水萃取，收集二氯甲烷相，即得到叶黄素。本专利技术的实验证明，本专利技术将IPP异构酶编码基因表达盒导入野生型小球藻中，得到转基因小球藻，该转基因小球藻的叶黄素含量和野生型小球藻相比最高提高30. 95% ；叶黄素产量和野生型相比最高提高36. 77%，为高产叶黄素小球藻。附图说明图1为重组质粒pCAMBIA2301_idi的构建过程示意2为基因工程小球藻的表型鉴定结果左图为小球藻原生质体与农杆菌共培养后涂布于筛选培养基有藻落长出，右图为小球藻原生质体未与农杆菌共培养涂布于筛选培养基没有藻落长出图3为基因工程小球藻在筛选培养基中进一步鉴定图4为PCR验证基因工程小球藻中idi基因的插入情况图5为PCR验证基因工程小球藻中NPTII基因的插入情况图6为基因工程小球藻和野生型小球藻的生物量示意7为基因工程小球藻和野生型小球藻的叶黄素含量示意8为基因工程小球藻和野生型小球藻的叶黄素产量示意图具体实施方式以下实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中所用的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特别说明，均购自常规生化试剂商店。克隆载体pBluescript II SK+ Stratagene, Catalog Number#212205o双兀载体pCAMBIA2301 CAMBIA, Canberra, Australia。质粒pGAPZ a A :1nvitrogen, Catalog Number V205-20。农杆菌菌株LBA4404 :1nvitrogen, Catalog Number 18313-015。酶处理液由溶质和溶剂组成；溶剂为20mM磷酸盐缓冲液(pH5. 8);溶质及其浓度如下2% (质量百分比)纤维素酶,2% (质量百分比)蜗牛酶和O. 2M KCl0FC培养基由水和溶质组成；溶质及其终浓度如下葡萄糖10g/L，胰蛋白胨2g/L，牛肉浸膏 lg/L，酵母浸膏 lg/L，FeSO4 · 7H20 2mg/L。TYNG培养基由水和溶质组成；溶质及其终浓度如下10g/L蛋白胨、5g/L牛肉浸膏、5g/葡萄糖、O. 2g/L 的 MgSO4 · 7H20，其余为水；pH7. 5。頂培养基由水和溶质组成；溶质及其终浓度如下=NaCl O. 15g/L、MgSO4 · 7H200. 25g/L、Κ2ΗΡ042· 28g/L、KH2PO4L 36g/L、CaCl2 · H2O 0. 078g/L、FeSO4O. 0025g/L、(NH4) 2S040. 53g/L、葡萄糖1. 98g/L、甘油 0. 54g/L、MES 7. 808g/L ；pH5. 3。筛选培养基由FC培养基、KC1、G418、氨苄青霉素和头孢霉素组成，KCl的浓度为O. 2mol/L, G418的浓度为450ug/mL，氨苄青霉素的浓度为300ug/mL，头孢霉素的浓度为300ug/mL。实施例1、重组质粒pCAMBIA2301_idi的构建一、大肠杆菌idi基因的克隆及相关载体的构建1、大肠杆菌idi基因的克隆以大肠杆菌DH5 α为材料，用酚-氯仿法提取大肠杆菌DH5 α基因组；具体如下取500uL DH5a菌液，12000r离心5min，获得菌体。加650uL裂解液，振荡2min，放入65°C水浴锅直至裂解澄清。加入等体积的平衡酚氯仿异戊醇(25:本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种培育转基因小球藻的方法，为将IPP异构酶编码基因导入目的小球藻中，得到转基因小球藻，所述转基因小球藻的叶黄素产量大于所述目的小球藻；所述IPP异构酶的氨基酸序列为序列表中的序列2。

【技术特征摘要】
1.一种培育转基因小球藻的方法，为将IPP异构酶编码基因导入目的小球藻中，得到转基因小球藻，所述转基因小球藻的叶黄素产量大于所述目的小球藻； 所述IPP异构酶的氨基酸序列为序列表中的序列2。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在在于所述IPP异构酶编码基因的核苷酸序列为序列表中序列I自5’末端第545-1093位核苷酸。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在在于所述IPP异构酶编码基因以IPP异构酶编码基因表达盒的形式导入目的小球藻； 所述IPP异构酶编码基因表达盒包括CAMV35S启动子、IPP异构酶编码基因和CYCl终止子； 所述IPP异构酶编码基因表达盒的核苷酸序列具体为序列表中的序列I。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在在于 所述IPP异构酶编码基因表达盒通过重组载体导入目的小球藻； 所述重组载体为将所述IPP异构酶编码基因表达盒插入表达载体中得到的载体；所述表达载体具体为PCAMBIA2301。5.根据权利要求4所述的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：林祥志，马瑞娟，荣辉，林汝榕，程汝滨，王昭凯，杨善军，马勇，陈水波，柯秀蓉，李惠丽，
申请(专利权)人：国家海洋局第三海洋研究所，
类型：发明
国别省市：