本发明专利技术公开了一种金银花中p-香豆酰酯3’-羟化酶基因LjC3’H及含所述基因LjC3’H的原核表达载体，同时还公开了所述金银花p-香豆酰酯3’-羟化酶基因LjC3’H在制备绿原酸中的应用。实验证实：将体外纯化的LjC3’H蛋白加入酶促反应体系中，能够将香豆酰奎尼酸和香豆酰莽草酸分别催化生成绿原酸和咖啡酰莽草酸，为开发生产提高目标产物绿原酸含量提供了理论依据和实践基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物基因工程
，尤其涉及一种金银花P-香豆酰酯3’-羟化酶基因LjC3’ H及其应用。
技术介绍
植物次生代谢是指有些生物体利用某些初生代谢产物为“原料”，在一系列酶的催化下，形成一些特殊的化学物质的过程，这些特殊的化学物质即为次生代谢产物，如生物碱、黄酮类、萜类、有机酸、木质素等，它们是植物中一大类并非生长所必需的小分子有机化合物，但对于植物自身在复杂环境中的生存和发展却起着不可替代的作用。植物次生代谢产物具有重要的经济价值。临床应用的药物，有很多都是取自植物的次生代谢产物。西方的临床药物中，大约25%是直接或间接地从植物中提取的次生代谢物。在我国，药用植物的应用历史更为悠久。此外，用作食品调味剂、日用芳香剂、杀虫剂等的植物次生代谢产物也倍受人们的青睐。随着基因工程技术的不断完善，对植物细胞代谢网络进行修饰和改造来积累大量目的产物已成为可能。目前，次生代谢产物关键酶基因的克隆及转化是植物次生代谢工程的研究热点。应用关键酶基因的代谢工程为提高植物组织、细胞培养及整体植株代谢产物的产量提供了技术平台。植物次生代谢产物种类繁多，生物合成途径也千差万别，只有在了解目标植物特定次生代谢途径的基础上，才能有选择地进行有效的基因操作。因此，植物次生代谢图谱的研究是植物次生代谢基因工程 必要的前提工作。中草药是中国传 统的药用植物，其有效成分绝大多数都来源于次生代谢产物，在植物中含量甚微，利用栽培措施大幅度地提高有效成分含量难度很大。通过次生代谢的基因工程，来提高中药材有效成分含量的研究刚刚起步。有效成分相关基因的克隆及其功能鉴定的有效方法还较少，且耗时，所获得的次级代谢途径中的相关基因较少。山东道地药材金银花(Lonicera japonica Thunb.)是忍冬科忍冬属(Lonicera)植物，具有抑菌、抗病毒、解热、抗炎、保肝、止血、抗氧化、免疫调节等作用。含有多种生物活性成分挥发油成分类、芳樟醇、棕搁酸、黄酮类化合物类(木犀草素、忍冬昔等)、绿原酸类(绿原酸和异绿原酸、咖啡酸及棕搁酸等)、三萜皂苷类(忍冬苦苷A和忍冬苦苷C)、P-谷甾醇等。一般认为绿原酸类化合物是金银花主要有效成分。绿原酸在清除自由基、水果和蔬菜的酶促褐变以及抗真菌和抗虫等方面具有重要功能。因此，提高绿原酸含量对改善金银花品质具有重要意义。绿原酸的生物合成属于植物的苯丙素类代谢途径。植物通过该途径合成了大量重要的次生代谢物质。羟基肉桂酸是木质素合成的中间产物，决定细胞壁的合成及物理化学性质。同时，羟基肉桂酸还是众多挥发类物质合成的前体，这些物质在植物化感作用中具有重要功能。咖啡酸和阿魏酸酯是植物体内重要的抗氧化物质。由苯丙烷生成的其它物质还参与了植物应对环境的生物和非生物胁迫，例如二苯乙烯和类黄酮都是重要的植物抗毒素。苯丙素类物质的生物合成至少需要两步羟化反应。首先是苯环的4号碳原子由肉桂酸羟化酶(C4H)催化羟化。C4H功能在植物中比较容易测定，是最早鉴定的P450家族成员之一。第二步羟化反应发生在苯环的3号碳原子，由P-香豆酰酯3’ -羟化酶(C3’ H)催化。目前对C3’ H的功能和酶活特性还不完全清楚。有研究表明C3’ H是依赖抗坏血酸、NADPH或者黄素的氧化酶。另有学者认为C3’H位于质体，利用质体醌或者铁氧化还原蛋白为电子供体。也有人认为3号碳原子的羟化反应是由P450以香豆酰奎尼酸或者香豆酰莽草酸为底物催化的。被子植物C3’ H属于细胞色素P450 CYP98家族，其催化的羟化反应不能以香豆酸单体为底物，只能催化香豆酰与莽草酸或者奎尼酸形成的复合物。拟南芥中C3’H功能丧失导致植株矮小，且高度不育，表明C3’ H在植物苯丙氨酸代谢途径中是必需的。尽管目前已经在许多物种中克隆到P-香豆酰酯3’-羟化酶基因，但是对于忍冬科植物金银花来说该基因的克隆、功能验证尚未见报道，并且对于该基因与绿原酸关系的研究也是未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种金银花中绿原酸相关基因一一P-香豆酰酯3’ -羟化酶基因LjC3’ H及其在制备绿原酸中的应用。本专利技术的技术方案是从金银花中分离得到P-香豆酰酯3’-羟化酶基因LjC3’H，在原核系统中验证功能，然后在原植株中研究其与绿原酸生物合成的关系。本专利技术所述的金银花P-香豆酰酯3’ -羟化酶基因LjC3’ H，其特征在于所述基因cDNA序列如SEQ ID No.1所示。本专利技术还提供了一种含上述金银花P-香豆酰酯3’ -羟化酶基因的原核表达载体pET28a-LjC3’ H，其特征在于所述载体克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。上述原核表达载体pET28a_LjC3’H的构建主要通过以下四步完成1)带有EcoRI和XhoI酶切位点的引物扩增目的基因LjC3’ H ；2)将目的基因LjC3’ H克隆入pMD18_T载体；3)将含有LjC3’ H基因的pMD18-T载体和pET28a载体分别用EcoRI和XhoI进行双酶切；4)将回收的LjC3’ H基因和pET28a载体连接。本专利技术所述金银花P-香豆酰酯3’ -羟化酶基因LjC3’H在制备绿原酸中的应用。本专利技术在金银花中克隆得到的基因LjC3’ H与其他物种中的类似基因相比同源性在46-77%之间。对其保守区分析发现，金银花中P-香豆酰酯3’ -羟化酶基因LjC3’ H的氨基酸序列含有4个CYP家族的保守域PPGP、I helix、PERF和PFGXGRRXCX。在已知其它物种中的P-香豆酰酯3’-羟化酶基因中都含有该保守域，该结构上的特征对于其功能的发挥具有一定的作用。实验证实将体外纯化的LjC3’ H蛋白加入酶促反应体系中，能够将香豆酰奎尼酸和香豆酰莽草酸分别催化生成绿原酸和咖啡酰莽草酸，其中所述绿原酸和咖啡酰莽草酸的含量由HPLC方法测定。本专利技术的有益效果利用现有的植物基因工程技术，本专利技术首次克隆得到了金银花中的P-香豆酰酯3’ -羟化酶基因LjC3’ H并进行了功能验证。通过不同诱导子处理金银花植株，经过比较分析证明，LjC3’H基因与绿原酸生物合成密切相关。故对于该基因LjC3’ H的研究具有重要都意义和应用前景。附图说明图1为金银花P-香豆酰酯3’ -羟化酶基因LjC3’ H的读码框电泳图其中1为 LjC3’ H 基因，M 为 Marker。图2为金银花P-香豆酰酯3’ -羟化酶基因LjC3’ H蛋白纯化图其中M，蛋白分子标准；1，未经IPTG诱导总蛋白；2，未经IPTG诱导的可溶性蛋白；3，经IPTG诱导总蛋白；4，经IPTG诱导的可溶性蛋白；5，回收的LjC3’ H蛋白。图3纯化的LjC3’ H蛋白催化香豆酰奎尼酸和香豆酰莽草酸的HPLC检测。图4不同诱导子处理条件下，金银花植株中LjC3’ H基因的表达分析。具体实施例方式实施例1、LjC3’ H的克隆1.1金银花总RNA的提取(I)金银花材料放入预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成均匀的粉末。注意研磨过程中要保证材料浸在液氮中。(2)待液氮挥发后将材料迅速转入预冷的离心管中，每50_100mg组织材料加入ImlTRIZOL溶液，混匀后，于室温放置5min，12000r/min, 2_8°C离心IOmin去沉淀。(3)每Iml TRIZO本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种金银花p?香豆酰酯3’?羟化酶基因LjC3’H，其特征在于：所述基因cDNA序列如SEQ?ID?No.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种金银花P-香豆酰酯3’ -羟化酶基因LjC3’ H，其特征在于所述基因CDNA序列如 SEQ ID No.1 所示。2.一种含有权利要求1所述基因LjC3’ H的原核表达载体p...
【专利技术属性】
技术研发人员：向凤宁，蒲高斌，王鹏，周冰谦，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：
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