本发明专利技术公开了一种米黑根毛霉菌株及其在制备β-葡聚糖酶和凝乳酶中的应用。本发明专利技术提供的米黑根毛霉(Rhizomucor?miehei)CAU432，其保藏编号为CGMCC?No.4967。本发明专利技术所提供的菌株米黑根毛霉CAU432耐热性好，且菌种稳定性好，产酶高，发酵成本低(利用的碳源和氮源易于购买，价格便宜)，生产周期短，适宜应用于工业化生产领域，具有较好的工业化应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种米黑根毛霉菌株及其在制备β -葡聚糖酶和凝乳酶中的应用。
技术介绍
β-葡聚糖(Glucan)是以葡萄糖为单体形成的高分子聚合多糖，广泛存在于植物和微生物的细胞壁中。葡聚糖酶(Glucanase)是一类重要的水解酶，作用于β-葡聚糖的I，3及I，4糖苷键；该酶可以有效分解麦类和谷类植物胚乳细胞壁中的β -葡聚糖；在饲料中可降低非淀粉多糖(NSP)及其抗营养因子的含量，改善畜禽对营养物质的吸收，提高畜禽的生长速度和饲料转化效率；在啤酒酿造上用于降低麦汁黏度，改善过滤性能，提高麦芽溶出率，防止啤酒浑浊，稳定啤酒质量等。迄今,微生物发酵产β -葡聚糖酶发酵的研究主要集中于木霉(Trichoderma)、曲霉(Aspergillus)和芽孢杆菌(Bacillus),而芽孢杆菌中研究较多的是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)和嗜喊芽抱杆菌(alkalophilic Bacillus sp.),且以枯草芽孢杆菌产酶活性最高。真菌发酵β_葡聚糖酶是以中温菌木霉和黑曲霉为主。嗜热真菌发酵产耐热β_葡聚糖酶的研究报道较少。凝乳酶(chymosin, EC3. 4. 23. 4)是一种从未断奶的小牛皱胃中发现的天门冬氨酸蛋白酶，其主要的生物学功能是有限切断酪蛋白的K-酪蛋白的Phe-Metl06连接的肽键，导致牛奶凝结，被广泛应用于干酪制造业，是食品领域中重要的酶制剂。凝乳酶的传统制备方法是从刚出生的小牛皱胃中提取，传统的提取方法与现代工业发展极不协调。研究者不断寻找新的凝乳酶来源 ，主要包括动物性凝乳酶、植物性凝乳酶及微生物凝乳酶。微生物生产周期短，产量大，生产凝乳酶的成本较低、酶提取方便。目前微生物凝乳酶应用最多的是微小毛霉(Mucor pusillus)产生的凝乳酶。国内外关于天然微生物液体发酵生产凝乳酶的专利申请较少，且产酶量偏低。目前生产凝乳酶水平普遍偏低，生产周期长和发酵成本较高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种米黑根毛霉菌株及其在制备β -葡聚糖酶和凝乳酶中的应用。米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)CAU432已于2011年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 4967。米黑根毛霉(Rhizomucor miehei) CAU43 2CGMCC No. 4967 简称米黑根毛霉 CAU432。本专利技术还保护一种用于培养所述米黑根毛霉CAU432的培养基，由碳源、氮源、无机盐和水组成；所述碳源为如下物质中的至少一种甘蔗皮、玉米苞皮、玉米杆、燕麦(优选)、麦麸、甘蔗渣、玉米芯、啤酒酒糟、稻壳、可溶性淀粉、几丁质、高粱杆、白酒酒糟、麸皮、稻草和葡萄糖；所述氮源为如下物质中的至少一种酵母提取物、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏蛋白胨(优选)、豆柏粉、黄豆粉(优选)、脱脂奶粉、蛋白胨、尿素、磷酸氢二铵、硫酸铵、酵母提取物和胰蛋白胨等质量混合得到的酵母蛋白胨混合物、硝酸铵和大豆蛋白胨；所述无机盐为如下物质中的至少一种KH2P04、MgSO4和CaCl2。所述培养基的pH可为自然pH或 pH 5. 0-7. O (如 pH 5. O, pH 6. O 或 pH 7. O)。所述培养基可由所述碳源、所述氮源、KH2PO4, MgSO4, CaCl2和水组成。所述培养基优选为如下(a)至(d)中任一所述的培养基(a)将所述碳源10g_50g(0. 45-0. 9mm粒径范围或O. 18-0. 3mm粒径范围的粉末)(如 10g、20g、30g、40g 或 50g)、氮源 10g、KH2PO4 5g、MgSO4 · 7H20 O. 3g 和 CaCl2 0. 3g 溶于水并用水定容至IL得到的培养基；(b)将所述碳源(O. 45-0. 9mm粒径范围或O. 18-0. 3mm粒径范围的粉末)和基础培养液甲混合得到的培养基；所述基础培养液甲的制备方法为将所述氮源log、KH2PO4 5g、MgSO4 ·7Η20 O. 3g和CaCl2 0. 3g溶于水并用水定容至IL得到的培养基；所述培养基的初始含水量为70-90% (质量百分 含量)(如70%、75% (优选)、80%、85%或90% )；(c)将所述碳源(O. 45-0. 9mm粒径范围或O. 18-0. 3mm粒径范围的粉末)、所述氮源和基础培养液乙混合得到的培养基；所述基础培养液乙的制备方法为将CaCl2 O. 3g、KH2PO4 5g、MgSO4 · 7H20 O. 3g和吐温-80 0. 34g溶于水并用水定容至IL ;所述培养基的初始含水量为30-75% (质量百分含量)(如33.3%、50% (优选)、60%、66· 7%、71· 4% )；所述碳源和所述氮源的质量比为5 I ；(d)将所述碳源10g_50g(0. 45-0. 9mm粒径范围或O. 18-0. 3mm粒径范围的粉末)(如 10g、20g、30g、40g、50g)、所述氮源 IOg^KH2PO4 5g、MgS04 ·7Η200· 3g 和 CaCl2 O. 3g 溶于水并用水定容至2. 5L得到的培养基。本专利技术还保护一种制备β -葡聚糖酶和/或凝乳酶的方法，是采用所述培养基发酵所述米黑根毛霉CAU432，得到β -葡聚糖酶和/或凝乳酶。所述方法具体可为如下⑴至⑷中的任意一种(I)采用(a)所述培养基50°C振荡发酵所述米黑根毛霉CAU432，得到β -葡聚糖酶；所述发酵的时间为I天以上，优选为1-6天，最优选为3-5天；(2)采用(b)所述培养基50°C静置发酵所述米黑根毛霉CAU432，得到β -葡聚糖酶；所述发酵的时间为I天以上，优选为1-6天，最优选为3-5天；(3)采用(C)所述培养基37°C静置发酵所述米黑根毛霉CAU432，得到凝乳酶；所述发酵的时间为I天以上，优选为1-6天，最优选为2天；(4)采用(a)所述培养基37°C振荡发酵所述米黑根毛霉CAU432，得到凝乳酶；所述发酵的时间为I天以上，优选为1-6天，最优选为3-5天；(5)在发酵罐中采用⑷所述培养基发酵所述米黑根毛霉CAU432，得到β _葡聚糖酶；所述发酵的条件为40-55°C (如50°C )、通气量为l-2vvm(如1. 2vvm)、搅拌速率为300-600rpm(如 500rpm)、发酵时间为 IOh 以上(如 10_72h，优选 50h)。所述方法(I)和/或所述方法(5)还包括如下步骤将所述发酵得到的发酵液10000 Xg冷冻离心lOmin，取上清液，即为含有β-葡聚糖酶的溶液。所述方法(2)还包括如下步骤将所述发酵得到的固体发酵物加入50mM pH 6. O柠檬酸缓冲液，室温下200rpm震荡浸提2h，IOOOOXg冷冻离心lOmin，取上清液，即为含有β-葡聚糖酶的溶液。所述方法(3)还包括如下步骤将所述发酵得到的固体发酵物加入去离子水，37°C、200rpm震荡浸提2h，IOOOOrpm冷冻离心lOmin，取上清液，即为含有凝乳酶的溶液。所本文档来自技高网...
【技术保护点】
米黑根毛霉(Rhizomucor?miehei)CAU432，其保藏编号为CGMCC?No.4967。
【技术特征摘要】
1.米黑根毛霉(Rhizomucormiehei) CAU432，其保藏编号为 CGMCC No. 4967。2.用于培养权利要求1所述米黑根毛霉的培养基，由碳源、氮源、无机盐和水组成；所述碳源为如下物质中的至少一种甘蔗皮、玉米苞皮、玉米杆、燕麦、麦麸、甘蔗渣、玉米芯、啤酒酒糟、稻壳、可溶性淀粉、几丁质、高粱杆、白酒酒糟、麸皮、稻草和葡萄糖；所述氮源为如下物质中的至少一种酵母提取物、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏蛋白胨、豆柏粉、黄豆粉、脱脂奶粉、蛋白胨、尿素、磷酸氢二铵、硫酸铵、酵母提取物和胰蛋白胨等质量混合得到的酵母蛋白胨混合物、硝酸铵和大豆蛋白胨；所述无机盐为如下物质中的至少一种KH2PO4、MgSO4 和 CaCl2。3.如权利要求2所述的培养基，其特征在于所述培养基由所述碳源、所述氮源、KH2PO4、MgSO4、CaCl2 和水组成； 所述培养基优选为如下(a)至(d)中任一所述的培养基(a)将所述碳源10g-50g、氮源 IOg^KH2PO4 5g、MgS04.7H20 0. 3g 和 CaCl2 0. 3g 溶于水并用水定容至IL得到的培养基； (b)将所述碳源和基础培养液甲混合得到的培养基；所述基础培养液甲的制备方法为将所述氮源10g、KH2P04 5g、MgS04 *7H20 0. 3g和CaCl2 0. 3g溶于水并用水定容至IL得到的培养基；所述培养基的初始含水量为70-90% ； (c)将所述碳源、所述氮源和基础培养液乙混合得到的培养基；所述基础培养液乙的制备方法为将CaCl2 0. 3g、KH2PO4 5g、MgSO4 7H20 0. 3g和吐温-80 0. 34g溶于水并用水定容至IL ;所述培养基的初始含水量为30-75% ;所述碳源和所述氮源的质量比为5:1;(d)将所述碳源10g-50g、所述氮源 10g、KH2PO4 5g、MgSO4 7H20 0. 3g 和 CaCl2O. 3g 溶于水并用水定容至2. 5L得到的培养基。4.一种制备3 -葡聚糖酶和/或凝乳酶的方法，是采用权利要求2或3所述培养基发酵权利要求1所述米黑根毛霉，得到P-葡聚糖酶和/或凝乳酶。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述方法为如下(I)至(5)中的任意一种 (...
【专利技术属性】
技术研发人员：江正强，唐艳斌，崔健，闫巧娟，杨绍青，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：
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