本发明专利技术公开了一种中华蜜蜂抗菌肽AccRoyalisin多克隆抗体的制备方法及用途。以大肠杆菌重组表达的中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin为抗原，免疫大白兔制备的多克隆抗体，该抗体效价大于40000倍；以此多克隆抗体为一抗，以重组表达的GST-AccRoyalisin为标准蛋白抗原作倍比稀释，用酶标仪通过Elisa法检测不同浓度GST-AccRoyalisin蛋白样品的吸光度，建立吸光度与MRJP1蛋白浓度的标准曲线。将不同蜂种或不同蜂群的血淋巴、蜂王浆冻干粉稀释后作为抗原，采用Elisa法检测得到样品的吸光度，代入所建立的标准曲线，计算得到样品的Royalisin的含量。本发明专利技术为Royalisin抗体提供了一种新的用途，为养蜂领域蜂中和蜂群抗病力的评价、抗病蜂群的选育，为蜂王浆防腐抗菌性能的评价提供了一种快捷的定性定量检测新方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程和免疫学领域，特别地，本专利技术涉及一种用中华蜜蜂(Apiscerana cerana)王衆抗菌妝AccRoyal is in基因融合表达产物GST-AccRoyalisin制备的多克隆抗体。更具体地说，本专利技术涉及AccRoyalisin抗体的制备方法，以及用该抗体Elisa法检测中华蜜蜂、意大利蜜蜂血淋巴中Royalisin含量，作为判断蜂种或蜂群抗病力的依据；以及用该抗体Elisa法检测蜂王衆中Royalisin含量,作为评价蜂王衆防腐性能的依据。
技术介绍
蜂王浆是蜜蜂头部王浆腺分泌的生物活性物质，具有促进人体生长发育，抗疲劳、提高免疫力、抗肿瘤、抗炎和抗菌等多种功能，作为人类的营养保健品历史悠久。Royalisin是蜂王浆中的一种抗菌肽，是蜜蜂受到微生物或其他外源有害物质侵染时由头部或胸部产生的一种低分子肽类。日本学者 Fujiwara 等(Fujiwara, S. et al. J. Biol. Chem.,1990，265: 11333-11·337)最初通过酸处理王浆，从王浆中分离获得了 Royalisin，其分子量为5523 Da，其一级结构由51个氨基酸残基组成，与蜜蜂血淋巴中的defensin序列几乎相同，仅第50位的氨基酸残基出现变化，由defensin中的精氨酸代替了王衆中Royalisin中的酪氨酸。Royalisin没有特异性，诱导产物不仅只对特定微生物，通常对其他微生物也有抗生作用。Bilikova 和 Bachanovci 等(Bilikova, K. , et al. Apidologie, 2001, 32:275-283; Bachanova, K. , et al. Apidologie, 2002, 33 : 259-269.)对从天然王浆中分离的Royalisin进行相应的抑菌试验，证实该多肽对革兰氏阳性细菌蜜蜂幼腐病菌(Paenibacillus larvae larvae)有很强的抑菌作用,在低至I μΜ的浓度下也具有抑菌作用；对革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌(Bucillus. subtilis )和藤黄八叠球菌(SarcinaIutea),包括灰霉菌Botrytis cinerea也有很好的抑菌作用，但对革兰氏阴性细菌无作用。在目前全世界已报道的9个蜜蜂属(々7k)成员中，只有西方蜜蜂(Apismellifera (其中分布最广的为意大利蜜蜂A. mellifera mellifera,简称意蜂)和东方蜜蜂(A. cerana)得到人工驯化和规模化人工养殖，并用于蜂蜜生产。相对于西方蜜蜂来说，东方蜜蜂认cerafla),包括我国特有的亚种中华蜜蜂(/I cerana简称中蜂)因生产性能较低，蜂群数量在原产地正处于萎缩状态。但国内外研究表明，因中华蜜蜂因长期适应于我国地理气候环境，具有西方蜜蜂所不具备的抗病性、耐寒性等抗逆性能，其生物学特点也非常不同于前者，在蜜蜂育种和生态多样性保护等方面具有非常重要的利用价值。因为抗菌肽在蜜蜂的自身防御系统里起着不可替代的作用。蜂螨和近年来爆发的蜜蜂崩塌病对西方蜜蜂危害十分严重，蜂病防治受到各国的高度重视，很多蜜蜂专家已在选育抗病品种作为最重要的防治手段方面开展了大量研究。近年国内学者(Xu，P., et al . PLoSONE. 2009, 4: 1-9.)研究表明，包括中华蜜蜂亚种在内的东方蜜蜂(如is 之所以抗病性优于意大利蜜蜂在内的西方蜜蜂，与其分泌抗菌肽能力强、种类多密切相关。 目前国际上已发现的抗菌肽分为四大类(a) cecropins, (b) defensins或sapecins, (c) attacin-like proteins, (d) proline-rich peptides。 Defensins 是昆虫抗菌肽中最多的一类，它包括了三个亚类精典defensins, β -defensins和昆虫defensins。Royalisin 属于昆虫 defensins 亚类。昆虫 defensins 亚类一般由 36-51 个氨基酸残基组成，三对二硫键，一个α-折叠、两个β折叠和一个N-端环组成的稳定结构，均具有抗革兰氏阳性细菌的活性(Cho, ff. L. , et al Insect Biochem. Molec. Biol.1996， 26: 395-402)。中蜂与意蜂的Royalisin氨基酸组成有95%以上的同源性。目前对Royalisin,除了西方蜜蜂的Royalisin基因序列和氨基酸序列有报道，从天然王浆中分离的Royalisin进行了抑菌试验外，目前国内外尚未见利用Royalisin抗体检测蜜蜂蜂种和蜂群血淋巴中Royalisin含量，以及蜂王浆中Royalisin含量，作为评价蜂种和蜂群抗病力、蜂王浆防腐性能的依据的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin基因重组表达产物制备多克隆抗体的方法及用途。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的 一种蜂王衆王衆抗菌肽AccRoyalisin抗体的制备方法,步骤如下 (1)以含中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin基因的该蜂头部cDNA为模板，用PCR方法扩增出其前体片段，并克隆入含GST编码基因的表达载体pGEX- 4T- 2中，将筛选获得的重组PGEX-4T-2/ AccRoyalisin转化大肠杆菌BL21中与谷胱甘肽融合进行表达；用亲和分离方法纯化目标蛋白GST-Acc Royalisin ； (2)以纯化的GST-AccRoyalisin作为抗原，免疫大白兔，取血清获得GST-AccRoyalisin 多克隆抗体。所述的方法制备的GST-AccRoyalisin多克隆抗体。所述的GST-AccRoyalisin多克隆抗体检测蜜蜂血淋巴中抗菌肽Royalisin含量的Elisa方法， (1)以GST-AccRoyalisin多克隆抗体为一抗，以重组表达GST-AccRoyalisin为标准抗原蛋白作倍比稀释，用酶标仪通过Elisa法,检测不同浓度GST-AccRoyalisin蛋白样品的吸光度，建立吸光度与AccRoyalisin蛋白浓度的标准曲线； (2)用中华蜜蜂和意大利蜜蜂血淋巴为抗原，以GST-AccRoyalisin多克隆抗体为一抗，采用Elisa法检测获得样品的吸光度，代入所建立的标准曲线，计算得到样品的Royalisin 含量。所述的Elisa方法应用于测定中华蜜蜂与意大利蜜蜂抗病菌能力的差异。所述的GST-AccRoyalisin多克隆抗体用于检测蜂王衆中抗菌肽Royalisin含量的Elisa方法， (I)以GST-AccRoyalisin多克隆抗体为一抗，以重组表达的GST-AccRoyalisin为标准抗原蛋白作倍比稀释，用酶标仪通过Elisa法,检测不同浓度GST-AccRoyalisin蛋白样品的吸光度，建立吸光度与AccRoyalisin蛋白浓度的标准曲线；(2)用蜂王浆冻干粉蛋白抽提物为抗原，以GST-AccRoyalisin多克隆抗体为一抗，采用Elisa法检测获得样品吸光度，代入所建立本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蜂王浆王浆抗菌肽AccRoyalisin抗体的制备方法，其特征在于，步骤如下：（1）以含中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin?基因的该蜂头部cDNA为模板,?用PCR?方法扩增出其前体片段,?并克隆入含GST编码基因的表达载体pGEX??4T??2?中，将筛选获得的重组pGEX?4T?2/?AccRoyalisin转化大肠杆菌BL21中与谷胱甘肽融合进行表达；用亲和分离方法纯化目标蛋白GST?Acc?Royalisin；（2）以纯化的GST?AccRoyalisin作为抗原，免疫大白兔，取血清获得GST?AccRoyalisin多克隆抗体。
【技术特征摘要】
1.一种蜂王衆王衆抗菌肽AccRoyalisin抗体的制备方法,其特征在于,步骤如下(1)以含中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin基因的该蜂头部cDNA为模板，用PCR方法扩增出其前体片段，并克隆入含GST编码基因的表达载体pGEX- 4T- 2中，将筛选获得的重组PGEX-4T-2/ AccRoyalisin转化大肠杆菌BL21中与谷胱甘肽融合进行表达；用亲和分离方法纯化目标蛋白GST-Acc Royalisin ；(2)以纯化的GST-AccRoyalisin作为抗原，免疫大白兔，取血清获得 GST-AccRoyalisin 多克隆抗体。2.—种如权利要求1所述的方法制备的GST-AccRoyalisin多克隆抗体。3.—种如权利要求2所述GST-AccRoyalisin多克隆抗体检测蜜蜂血淋巴中抗菌肽 Royalisin含量的Elisa方法,其特征在于，(1)以GST-AccRoyalisin多克隆抗体为一抗，以重组表达GST-AccRoyalisin为标准抗原蛋白作倍比稀释，用酶标仪通过Elisa法,检测不同浓度GST-AccRoyalisin蛋白样品的吸光度，建立吸光度...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈立荣，李玫璐，王一然，谭量量，金凤，丁美会，陈正贤，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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