一种人肌红蛋白酶促化学发光免疫检测方法和试剂盒技术

本发明专利技术属于免疫检测分析技术领域，具体提供了一种人肌红蛋白酶促化学发光免疫检测方法，所述方法包括形成固相-抗体-抗原-酶标二抗免疫夹心复合物以及用化学发光的方法检测所述免疫夹心复合物的步骤。本发明专利技术还提供了一种人肌红蛋白酶促化学发光免疫检测试剂盒。本发明专利技术提供的检测方法和检测试剂盒适用于人肌红蛋白的检测分析，并且具有检测范围大、灵敏度和特异性高的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于免疫检测分析
，具体提供了一种人肌红蛋白酶促化学发光免疫检测方法和试剂盒，适用于人肌红蛋白的酶促化学发光检测分析。
技术介绍
人肌红蛋白(myoglobin, Myo)是低分子量的细胞质蛋白，广泛存在于骨骼肌和肌细胞中，其在前者中的含量高于后者。当急性肌缺血(acute myocardial ischemia,AMI)发生时Myo即明显升高，可持续至12h，并且具有较高的敏感性。但由于骨骼肌疾病、肾功能损害、炎症、系统性红斑狼疮、皮肌炎均可引起Myo升高，其作为AMI的诊断指标特异性较低。但由于其较高的灵敏度，一般作为排查指标，对于排除肌梗死和再通后再梗死意义重大。目前人肌红蛋白的检测方法主要有酶联免疫吸附实验(Enzyme-1 inkedimmunosorbent assay, ELISA)和胶体金免疫层析法(Gold-1mmunochromatography assay,GICAhELISA方法具有操作简单、技术可靠、试剂方便易得等优点，但其敏感性、特异性不够高，作为定量方法不够准确；GICA方法简便、快速、可单份或成批测定，但其灵敏度更低于ELISA方法，而且通常情况下只能做为定性方法，而不能作为定量方法。化学发光(ChemiLuminescence,简称为CL)分析法是分子发光光谱分析法中的一类，其原理是在化学反应中生成的不稳定的激发态中间体，当其回到基态时，释放光子。化学发光分析法主要是依据化学检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理，利用仪器对体系化学发光强度的检测，而确定待测物含量的一种痕量分析方法。在免疫检测分析中，使用化学发光技术，可以使检测的范围达到6个数量级，而且灵敏度很高，达10_18摩尔水平，加上标记物稳定，有效期长，使其受到越来越多的关注与应用。但目前尚没有利用化学发光分析法测量人肌红蛋白的研究和应用。
技术实现思路
为了进一步提高人肌红蛋白检测的敏感性、特异性和准确度，专利技术人将酶促化学发光分析方法应用于人肌红蛋白的检测中，经过大量的实验，摸索出一种灵敏、准确且稳定的检测方法，由此完成了本专利技术。本专利技术一个方面涉及一种人肌红蛋白检测方法，其包括以下步骤(I)将抗人肌红蛋白抗体固定在固相表面，加入待测样本和标记的抗人肌红蛋白抗体，温育，然后用洗涤液洗涤；任选地，同时设立人肌红蛋白标准品的对照；(2)加入化学发光底物工作液，放置一段时间；(3)测量发光值，得到待测样本的人肌红蛋白浓度值。其中步骤⑴中的温育为，在18-42 °C条件下，优选为20-37 °C条件下，温育5-120min，优选为温育10_60min，更优选为15_45min，在本专利技术的一个实施方案中，在37°C条件下，温育30min。其中步骤(2)中的放置放一段时间是指l-30min，优选为2-20min。在本专利技术的一个实施方案中，放置时间为5min。具体地，检测方法如下1.在固定有抗人肌红蛋白单克隆抗体的聚苯乙烯微孔板中加入5-100 μ L血清或血浆样本，标准品，混匀；加入辣根过氧化物酶标记的抗人肌红蛋白单克隆抗体，37°C温育10-60分钟。在本专利技术的一个实施方案中，温育30min。2.洗涤可采用手工洗涤或洗板机洗涤。手工操作方法为直接排除包被板中的液体，并加入洗涤液(300 μ L/孔)，倒出洗涤液并拍击以除去挂壁液体，重复三次,洗板机操作见仪器说明书。3.加入化学发光底物工作液每孔加入50-400 μ L，所述发光底物工作液包括底物溶液、辅助发光溶液和反应增强剂。混匀后2-20分钟测量。4、读取发光值在发光测定仪上测定每孔的发光值。本专利技术的另一方面涉及人肌红蛋白检测试剂盒，其包括连接有抗人肌红蛋白抗体的微孔板，标记的抗人肌红蛋白抗体和化学发光底物工作液。在本专利技术中，所述化学发光底物工作液包括底物溶液、辅助发光溶液和反应增强剂。在本专利技术中，所述试剂盒还可以包括洗涤液，人肌红蛋白标准品和质量控制血清。在本专利技术中，待测样本可以为血清、血浆或其它体液，例如唾液，在本专利技术的一个实施方案中，待测样本为血清。在本专利技术中，所述的固相化的抗人肌红蛋白抗体和用来标记的抗人肌红蛋白抗体各自独立地为单克隆抗体或多克隆抗体，在本专利技术的一个实施方案中，固相化的抗人肌红蛋白抗体和标记(酶标)的抗人肌红蛋白抗体均为单克隆抗体；其中固相化的抗人肌红蛋白抗体与标记的抗人肌红蛋白抗体可以相同，也可以不相同。在本专利技术的一个实施方案中，所述的固相化的抗人肌红蛋白抗体和标记的抗人肌红蛋白抗体购自Medix Biochemica公司。在本专利技术的一个具体实施方案中，所述的固相化的抗体和标记的抗体均为Medix Biochemica公司的抗人肌红蛋白单克隆抗体,克隆号为7001和7004，其对应的货号分别为100075和100076。在本专利技术的另一个具体实施方案中，所述的固相化的抗体和标记的抗体均为Medix Biochemica公司的抗人肌红蛋白单克隆抗体，克隆号为7004和7005，其对应的货号分别为100076和100078。对于上述的每一对抗体，当其中一个作为固相化抗体时，另一个即为标记的抗体。所述人肌红蛋白抗体(包括固相化和标记的抗体)可以是利用免疫学中常用的动物制备的抗体，例如鼠抗人肌红蛋白抗体、兔抗人肌红蛋白抗体或羊抗人肌红蛋白抗体，在本专利技术的一个实施方案中，为鼠抗人肌红蛋白抗体。在本专利技术中，所述的标记抗人肌红蛋白抗体的标记物为过氧化物酶，例如为辣根过氧化物酶或烟草过氧化物酶；所述底物为在一定条件下，能被所述酶激发发光的物质；在本专利技术的一个实施方案中，所述标记物为辣根过氧化物酶，所述底物为鲁米诺或其衍生物。所述鲁米诺衍生物包括但不限于异鲁米诺、4-氨基己基-N—乙基异鲁诺、及N-(6-氨基己基)-N-乙基异鲁米诺(AHEI)和N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)。在本专利技术中，所述辅助发光的溶液包括但不限于过氧化氢溶液、铁氰化钾溶液、碘化物溶液、高锰酸钾溶液，在本专利技术的一个实施方案中，为过氧化氢溶液；所述反应增强剂为能增强底物发光的物质，当底物为鲁米诺或其衍生物时，反应增强剂包括但不限于对碘苯酹、对溴苯酹，在本专利技术的一个实施方案中，为对碘苯酹。底物溶液在辅助发光溶液和反应增强剂的作用下发光，发光的强度与样本中人肌红蛋白的含量成正比。 在本专利技术中，洗涤液为能够去掉抗原抗体间非特异性结合的液体，例如磷酸盐缓冲液(PBS溶液)或三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液，同时还含有吐温_20，吐温-20的浓度为O. 1-1%。，优选为O. 2-0. 8%。，更优选为O. 3-0. 6%。。在本专利技术的一个实施方案中，洗涤液(IOOOml)的成分包括氯化钠(NaCl) 2g，磷酸二氢钠(NaH2PO4. 12H20) 2. 9g，磷酸氢二钾(K2HPO4) O. 2g，氯化钾(KCl)O. 2g，曲拉通X-100 O. 5mL，吐温-20 O. 5mL，布兰尼道克斯(Bronidox-L) 5g。在本专利技术中，将抗人肌红蛋白单克隆抗体连接在聚苯乙烯微孔板作为固相试剂。所述的抗体与微孔板的连接，可以是直接的，也可以是间接的(如通过生物素-亲和素系统等)；可以通过物理吸附(静电作用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人肌红蛋白检测方法，其包括以下步骤：(1)将抗人肌红蛋白抗体固定在固相表面，加入待测样本和标记的抗人肌红蛋白抗体，温育，然后用洗涤液洗涤；任选地，同时设立人肌红蛋白标准品的对照；(2)加入化学发光底物工作液，放置一段时间；(3)测量发光值，得到待测样本的人肌红蛋白浓度值。

【技术特征摘要】
1.一种人肌红蛋白检测方法，其包括以下步骤(1)将抗人肌红蛋白抗体固定在固相表面，加入待测样本和标记的抗人肌红蛋白抗体，温育，然后用洗涤液洗涤；任选地，同时设立人肌红蛋白标准品的对照；(2)加入化学发光底物工作液，放置一段时间；(3)测量发光值，得到待测样本的人肌红蛋白浓度值。2.人肌红蛋白检测试剂盒，其包括连接有抗人肌红蛋白抗体的微孔板，标记的抗人肌红蛋白抗体和化学发光底物工作液，所述化学发光底物工作液包括底物溶液、辅助发光溶液和反应增强剂。3.权利要求2的试剂盒，其还包括洗涤液和人肌红蛋白标准品。4.权利要求1的检测方法或权利要求2的试剂盒，其中所述的固相化抗人肌红蛋白抗体和标记的抗人肌红蛋白抗体各自独立地为单克隆抗体或多克隆抗体，优选为单克隆抗体；所述的固相化抗人肌红蛋白抗体和标记的抗人肌...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐磊，朱琳琳，吴旭东，孙旭东，杨晓林，吴晓东，
申请(专利权)人：北京源德生物医学工程有限公司，
类型：发明
国别省市：