本发明专利技术涉及一种谷氨酸脱羧酶热稳定变体G56P基因，其核苷酸序列在第56位有定点突变。研究发现，此位点突变后得到的变体基因编码的谷氨酸脱羧酶的热稳定性有所增强。本发明专利技术通过在编码野生GAD酶基因基础上进行定点突变，提高了其对应变体酶在在60℃和70℃下的热稳定性。随着酶热稳定性的提高，在工业生产过程中可以采用更高的操作温度，以提高反应速率、增加底物溶解度，有利于利用该酶通过生物转化生产GABA。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及一种谷氨酸脱羧酶变体G56P基因及其用途。
技术介绍
定点突变(site-directed mutagenesis 或 site-specific mutagenesis)是指在目的DNA片段的指定位点上引入特定的碱基对变化的技术。它是研究蛋白质结构与功能之间的复杂关系的有力工具，也是在实验室中改造基因的常用手段。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质的结构和功能特征，有助于了解蛋白质结构和功能的关系。特别是在酶的理性设计中，或利用随机突变等定向进化技术筛选得到具有潜力的重要氨基酸位点后，进行定点突变分析，将有利于进一步了解该位点在蛋白质结构和功能的关系中所发挥的作用。谷氨酸脱羧酶(glutamatedecarboxylase,简称 GAD ；EC4.1.1. 15)是一种广泛地存在于植物、动物和微生物中的氨基酸脱羧酶，它可以专一地催化L-谷氨酸的a -羧基脱羧反应生成Y-氨基丁酸(Y-aminobutyric acid,简称GABA)。GABA是哺乳动物神经系统的一种关键的神经递质抑制剂，具有抑制中枢神经系统过度兴奋、解除神经紧张等生理功能。由于身心紧张会导致人体血压升高、免疫功能失调、代谢紊乱，因此GABA对人体具有镇静安神、促进睡眠、健脑益智、降低血压，改善免疫功能，延缓衰老等作用，是一种在食品和医药领域具有广泛应用的天然氨基酸，已被国家卫生部批准为“新资源食品”。目前，利用谷氨酸脱羧酶或具有该酶活力的细胞进行GABA的生物制备正得到越来越多的重视。作为生物技术 富集生产GABA的关键酶，细菌GAD的热稳定性一直是限制其在大规模生物反应器中应用的因素之一。细菌GAD的最适温度一般在30 50°C之间，然而在60°C以上酶的活力下降较快。而在工业生产过程中，往往希望采用更高的操作温度，这有利于提高反应速率、增加底物溶解度、降低体系粘度，从而提高生物催化与转化的效率。中国专利申请200510049189. 4和中国专利申请200510049187. 5公开了一种生产Y-氛基丁酸的短乳杆菌(Lactobacillus brevis) CGMCC NO. 1306,对该菌株的GAD基因进行克隆，构建重组质粒，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，可实现可溶表达。但是，该基因表达的GAD在60°C及以上的环境中很快失活，不利于该酶在GABA生物制备中的应用。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题首先是提供一种谷氨酸脱羧酶的变体基因，其编码对应的变体酶在60°C和70°C下的热稳定性有明显提高，从而在工业生产过程中可以采用更高的操作温度，以提高反应速率、增加底物溶解度，有利于利用该酶通过生物转化生产GABA。本专利技术进一步的目的是提供上述变体基因编码的谷氨酸脱羧酶或包含上述变体基因的表达单元、重组质粒、或转化子。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是一种谷氨酸脱羧酶热稳定变体G56P基因，其核苷酸序列在第56位有定点突变。研究发现，此位点突变后得到的变体基因编码的谷氨酸脱羧酶的热稳定性有所增强。本专利技术研究的基础是来自短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO. 1306中的GAD基因。其中短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO. 1306 已在中国专利申请 200510049189. 4 和中国专利申请200510049187. 5中公开，由浙江大学保藏在中国普通微生物保藏管理中心(地址北京市朝阳区北辰西路I号院)。本申请使用的是浙江大学馈赠的。经研究发现，短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)CGMCC NO. 1306 中的 GAD 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，本申请将该基因第56位甘氨酸(Gly)的密码子GGA突变为脯氨酸(Pro)的密码子CCC，序列长度没有变化。得到的谷氨酸脱羧酶热稳定变体G56P基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。一种由上述谷氨酸脱羧酶热稳定变体G56P基因编码的谷氨酸脱羧酶。其氨基酸序列优选如SEQ ID N02所示。一种包含上述谷氨酸脱羧酶热稳定变体G56P基因的谷氨酸脱羧酶表达单元、重组质粒或转化子。表达单元的启动子可以为常用的T7启动子、Iac启动子或araBAD启动子。在这些启动子的作用下，突变酶可以直接在大肠杆菌宿主细胞(如BL21(DE3))中实现胞内可溶表达。本专利技术通过在编码野生GAD酶基因基础上进行定点突变，提高了其对应变体酶在60°C和70°C下的热稳定性。本专利技术特异性选择对编码GAD第56位氨基酸残基位点的密码子进行替换，且采用编码脯氨酸的密码子替换编码谷氨酸的密码子、使GAD的第56位氨基酸残基由野生型的谷氨酸突变为脯氨酸，是因为采用分子设计方法对GAD上各氨基酸残基对GAD热稳定性的影响进行了分析，发现第56位氨基酸残基位点是一个对GAD的热稳定性有重要影响的氨基酸。基于氨基酸性质与蛋白质结构和性质间的关系，研究发现在该位点采用脯氨酸替换甘氨酸可以增加GAD蛋白质结构的刚性、提高GAD对热的稳定性。因此，设计了引物，通过定点突变方法构建了谷氨酸脱羧酶的热稳定突变体G56P。随着谷氨酸脱羧酶热稳定性的提高，在工业生产过程中可以采用更高的操作温度，以提高反应速率、增加底物溶解度，有利于利用该酶通过生物转化生产GABA。附图说明图1为质粒pET28a(+)_gad的基因图谱；图2为突变位点Gly56在GAD三级结构中的位置图(以球表示)；图3为定点突变原理示意图；图4为野生型GAD酶基因PCR扩增产物凝胶电泳图谱；图5为突变酶和野生型GAD在60°C的热稳定性；图6为突变酶和野生型GAD在70°C的热稳定性。具体实施例方式为进一步说明本专利技术，结合以下实施例具体说明一、 构建重组质粒将短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO. 1306培养至对数生长中期，取4. 5mL菌液IOOOOrpm离心一分钟后弃去上清，利用试剂盒(上海生工)按说明书提取基因组 DNA。设计如下简并引物上游简并引物5'-cgggatccatggcffatgttRtaYggffaaac-31 (如 SEQ ID NO. 5 所示)；下游简并引物5'-gggaattcttagtgHgtgaaYccgtattt-3;(如 SEQ ID NO. 6 所示)；其中，上游引物中的“ggatcc”为BamH I酶切位点，下游引物中的“gaattc”为EcoRI酶切位点。分别用上游引物和下游引物配对，选择和优化不同的模板/Pfu/引物比例，退火温度，循环次数，以所得基因组DNA为模板进行PCR，以得到扩展片段大小合适、丰度合适和非特异条带少的PCR结果，最终通过条件的优化，得到了一个长度约为1400bp的DNA条带。所确定的PCR 体系组成为ddH20,38. 5 u L ； 10 X Pfu buffer，5 uL ;上游引物0. 5u L ;下游引物，0. 5u L ；dNTP,4u L ;模板 DNA, 1u L ；Pfu,0. 5u L ;反应总体积为 50 u L。所用的PCR条本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种谷氨酸脱羧酶热稳定变体G56P基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列在第56位有定点突变。
【技术特征摘要】
1.一种谷氨酸脱羧酶热稳定变体G56P基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列在第 56位有定点突变。2.根据权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶热稳定变体G56P基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列第56位的密码子GGA突变为CCC。3.根据权利要求2所述的谷氨酸脱羧酶热稳定变体G56P基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。4.权利要求1-3任一项所述的谷氨酸脱羧酶热稳定变体G56P基因编码的谷氨酸脱羧酶。5.根据权利要求4所述的谷氨酸脱羧酶，其特征在于所述谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO...
【专利技术属性】
技术研发人员：梅乐和，郁凯，胡升，黄俊，
申请(专利权)人：浙江大学宁波理工学院，
类型：发明
国别省市：
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