JAM1基因修饰间充质干细胞的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及干细胞及基因工程技术领域。本发明专利技术提供了一种链接粘附分子JAM1基因修饰间充质干细胞的方法，具体为设计引物，以人表皮细胞总RNA为模板，通过RT-PCR扩增，制备JAM1cDNA，再构建重组人peGFP-N1-JAM1真核表达载体，为提高转染效率，构建慢病毒过表达质粒pGC-FU-JAM1-GFP；将慢病毒感染人胚源性间充质干细胞（hMSC）。本发明专利技术还提供了上述方法在制备促进毛发再生的干细胞和细胞移植促进局部皮肤毛发再生中的应用。本发明专利技术的JAM1ov-hMSC皮内移植到3周龄裸鼠皮肤组织，在裸鼠皮肤微环境的诱导下，JAM1ov-hMSC迁移到裸鼠毛囊，使裸鼠毛囊生长期延长，毛囊结构改善，毛发再生。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及干细胞及基因工程
，具体涉及一种JAMl基因修饰间充质干细胞的方法，及其在制备促进毛发再生的干细胞和细胞移植促进局部皮肤毛发再生中的应用。
技术介绍
现在越来越多的人都会由于多方面的生活上面的因素而造成脱发现象的发生。毛囊周期是毛囊在成体哺乳动物中经历一系列的周期活动，可分为生长期、退行期和停滞期。男女脱发都表现为进行性毛囊微型化，导致毛发生长周期缩短。由于生长期缩短，毛发变稀疏、变短到根本不生长的程度。由于大部分脱发是逐渐发展的，所以治疗开始得越早疗效越好。随着干细胞研究的深入，人们尝试进行细胞移植来治疗毛发再生。本申请人前期分离获得了人胚源性间充质干细胞(hMSC)，且发现这种可以分化为毛囊相关组织，如毛囊上皮细胞，毛乳头细胞(参见文献(I)Wu MJ, Yang L1Liu SR，Li HH, Hui N，Wang FM, LiuH*. Differentiation Potential of Human EmbryonicMesenchymal Stem Cells for SkinRelative Tissue. British J Dermatol, 2006, 155:282 - 291. ；(2)Wu M, Sun Q, Guo X andLiu H(2012)hMSCs possess thepotential to differentiate into DP cells in vivoand in vitro. Cell Biol.1nt. Rep 19 (2) : art: e00019. do1: 10. 1042/CBR20120003 ;参见中国专利专利号ZL200610025317. 6，公开号CN1834253A，专利技术名称人早胚来源的表皮或毛囊干细胞的制备及应用)。这为我们采用hMSC诱导毛发再生奠定了基础。链接粘附分子JAMl (GENBANK No : NM_016946 )是一个跨膜分子，属于免疫球蛋白超家族。JAMl可以在同源二聚化之后形成多蛋白的大的复合体，这种复合体介导细胞由外到内的信号传递。此外，JAMl在细胞迁移，器官发育及上皮细胞分化等方面也有重要作用(参见文献(I) Severson EA, Lee WY, Capaldo CT, Nusrat A, ParkosCA. Junctional adhesion molecule A interacts withAfadin and PDZ-GEF2 to activateRap IAj regulate betal integrin levels,andenhance cell migration. MolecularBiology of the Cell Vol. 20，1916 - 1925. ； (2)Nava P,Capaldo CT,Koch S，et. al. JAM-Aregulates epithelial proliferation throughAkt/旦-catenin signalling. EMBORep. 2011Apr; 12(4) :314-20.)细胞通过其表面的粘附分子与另一个细胞上的粘附分子受体发生相互作用，来调节细胞连接的形成。在粘附分子中一个很大的家族是免疫球蛋白超家族。而在内皮细胞和上皮细胞的紧密连接处最初被鉴定的免疫球蛋白样分子就是JAM家族。直到后来才知道JAMl就是最初被鉴定的抗血小板的抗体即Fll受体。JAM-B和JAM-C是JAM家族的另外两个成员，也表达于内皮细胞尤其是高内皮微静脉。近期的一些研究结果，JAMl可以跟含有PDZ结构域的蛋白结合提示JAMl与紧密连接形成有关。PDZ结构域涉及到蛋白和蛋白相互作用并经常在同一蛋白中多次重复。在多数情况下，PDZ结构域可以识别结合蛋白的C-末端。三种JAMs的C-末端均含有II型I3DZ结合结构域。含有PDZ结构域的蛋白通常是用于在质膜的亚细胞结构上构建大的蛋白复合体的支架蛋白。这些含有PDZ结构域的蛋白包括ZO-1 (zonula occludens-1)和Par_3 (partitioning-defectiveprotein-3)等。在特定的体内外微环境条件下，干细胞能够诱导分化为各种组织细胞，为多种疾病的治疗拓展了新的治疗途径。干细胞在不同部位分化为不同组织细胞，组织微环境在调控干细胞分化方向上起了重要作用。基因修饰可调节干细胞分化，并增强目的基因的表达。目前较为安全的基因修饰方法是慢病毒感染。慢病毒基因载体是由I型人免疫缺陷病毒改造的新型病毒载体，作为一种高效的基因转染载体应用越来越广泛，经多次修饰改造其转导效率和安全性都得到了保证。目前尚无文献报道有关JAMl基因修饰间充质干细胞，及其在促进局部皮肤毛发再生中的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种JAMl基因修饰间充质干细胞的方法，本专利技术的另一目的在于提供JAMl基因修饰间充质干细胞的方法在制备促进毛发再生的干细胞和细胞移植促进局部皮肤毛发再生中的应用。申请人:基于JAMl可促进细胞迁移，调节上皮细胞重排；hMSC可以分化为毛囊相关组织等实验依据，构建含目的基因JAMl慢病毒过表达载体，将其转染hMSC，以便用表达的外源性JAMl启动信号转导，获得JAMl高表达hMSC，称之为JAMl°v-hMSC。将104JAMl°v_hMSC采用皮内注射的方式移植到3周龄裸鼠皮肤组织，此时裸鼠毛囊处于退行期。2周后注射处有明显可见毛发生成。本专利技术的第一方面，是提供一种JAMl基因修饰间充质干细胞的方法，具体内容是根据JAMl的基因结构，设计一对引物，以人表皮细胞总RNA为模板，通过RT-PCR扩增，制备JAMlcDNA,再构建重组人peGFP-Nl-JAMl真核表达载体，为提高转染效率，构建慢病毒过表达质粒pGC-FU-JAMl-GFP。将慢病毒感染人胚源性间充质干细胞(hMSC)。本专利技术提供了一种链接粘附分子JAMl基因修饰间充质干细胞的方法，包括以下步骤A、设计并合成引物如下Pl CCTGAAGCTTATGGGGACAAAGGC (SEQ ID NO:1)P2 ACCAGGATCCAACACCAGGAATGACGAGG (SEQ ID NO:2);以人表皮细胞总RNA为模板，通过RT-PCR扩增，制备JAMlcDNA (SEQID NO: 3)B、构建慢病毒过表达质粒pGC-FU-JAMl-GFP (常规方法)；C、将pGC-FU-JAMl-GFP颗粒感染人早胚来源的间充质干细胞(hMSC)，获得JAMl高表达的hMSC，S卩JAMl°v-hMSC (常规方法)。上述方法中，步骤B具体为(I)设计并合成引物如下 JAMl-Age1-F 如 SEQ ID N0:4 所示，JAMl-Age1-R 如 SEQ ID NO: 5 所示，Ub1-F 如 SEQ ID NO:6 所示，EGFP-N-R 如序列 SEQ ID NO: 7 所示；(2)采用PCR方法从JAMl真核表达载体中钓取目的基因；(3)使用Age I对获得的JAMl过表达质粒和病毒载体进行酶切以获取线性化模板；(4) PCR产物交换进入线性化慢病毒载体制备本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种链接粘附分子JAM1基因修饰间充质干细胞的方法，包括以下步骤：A、设计并合成引物如下：上游引物如SEQ?ID?NO:1所示，下游引物如SEQ?ID?NO:2所示；以人表皮细胞总RNA为模板，通过RT?PCR扩增，制备JAM1cDNA序列如SEQ?ID?NO:3所示；B、构建慢病毒过表达质粒pGC?FU?JAM1?GFP；C、将慢病毒过表达质粒pGC?FU?JAM1?GFP颗粒感染人早胚来源的间充质干细胞，获得JAM1高表达的人早胚来源的间充质干细胞，即JAM1ov?hMSC。

【技术特征摘要】
1.一种链接粘附分子JAMl基因修饰间充质干细胞的方法，包括以下步骤A、设计并合成引物如下上游引物如SEQ ID NO:1所示，下游引物如SEQ ID N0:2所示；以人表皮细胞总RNA为模板，通过RT-PCR扩增，制备JAMlcDNA序列如SEQ ID NO: 3所示；B、构建慢病毒过表达质粒pGC-FU-JAMl-GFP；C、将慢病毒过表达质粒pGC-FU-JAMl-GFP颗粒感染人早胚来源的间充质干细胞，获得JAMl高表达的人早胚来源的间充质干细胞，即JAMl°v-hMSC。2.根据权利要求1所述的一种链接粘附分子JAMl基因修饰间充质干细胞的方法，其特征在于，步骤B具体为设计并合成引物如下JAMl-Age1-F 如 SEQ ID NO:4 所示，JAMl-Age1-R 如 SEQ ID NO: 5 所示，Ub1-F 如 SEQ ID NO:6 所示，EGFP-N-R 如序列 SEQ ID NO: 7 所示；采用PCR方法从JAMl真核表达载体中钓取目的基因；使用Age I对获得的JAMl过表达质粒和病毒载体进行酶切以获取线性化模板；PCR产物交换进入线性化慢病毒载体制备慢病毒过表达质粒pGC-FU-JAMl-GFP。3.根据权利要求1或2所述的一种链接粘附分子JAMl基因修饰间充质干细胞的方法，其特征在于，步骤C具体为先将10 μ L三个不同梯度...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘厚奇，仵敏娟，郭晓灿，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：