原核表达构建体制造技术

技术编号:8538705 阅读:186 留言:0更新日期:2013-04-05 02:53
在本文中报道了一种多肽原,其可用于在原核细胞中表达目标多肽。因此,所述多肽原融合到目标多肽的N-端。在本文中报道的多肽原提供提高的表达产量,并改善融合多肽的处理(下游加工、纯化)。例如,当使包含所述多肽原的目标蛋白例如与亲和色谱材料结合时,实现有效的内毒素除去。此后,多肽原可通过掺入的蛋白酶切割位点用相关蛋白酶从目标多肽有效地切割。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】原核表达构建体在本文中报道了一种用于在原核细胞中生产多肽的表达构建体。所述表达构建体包含多肽原,所述多肽原在N端至C端方向包含二肽GS、氨基酸标签、二肽GS和蛋白酶切割位点。
技术介绍
用于生产重组多肽的表达系统是在现有技术中众所周知的,且描述在例如,Marino, Μ. H. , Biopharm. 2 (1989) 18-33 ;Goeddel, D. V.,等人,Methods Enzymol. 185 (1990) 3-7 ;ffurm, F.,和 Bernard, A. , Curr. Opin. Biotechnol. 10(1999) 156-159。通常在哺乳动物细胞(诸如CHO细胞、NSO细胞、SP2/0细胞、COS细胞、HEK细胞、 BHK细胞、PER.C6 细胞等等)中生产用于药用的多肽(诸如抗体和抗体融合体)。真核表达质粒的元件通常是原核质粒扩增单位,例如就大肠杆菌(E. coli)而言,包含原核复制起点和原核选择标记、真核选择标记、以及一个或更多个用于表达目标结构基因的表达盒, 所述表达盒各自含有启动子、结构基因和转录终止子,包括多腺苷酸化信号。为了在哺乳动物细胞中进行瞬时表达,可包含哺乳动物复制起点,诸如SV40 Ori或OriP。可选择组成型或诱导型启动子作为启动子。为了优化转录,可在5’非翻译区中包含Kozak序列。为了 mRNA加工,尤其是mRNA剪接和转录终止,可包含mRNA剪接信号(取决于结构基因的组织 (外显子/内含子组织))以及多腺苷酸化信号。可以在原核细胞、酵母中,且主要在大肠杆菌中,生产用于药用的其它多肽,例如胰岛素、干扰素ct-2、垂体生长激素、白介素-2、GM-CSF和瑞替普酶(Reteplase)。大肠杆菌表达质粒的元件通常是复制起点、选择标记、以及一个或更多个用于表达目标结构基因的表达盒。表达盒通常包含启动子、结构基因和转录终止子。可选择组成型或诱导型启动子作为启动子。为了优化转录,可在5’非翻译区中包含在mRNA的起始密码子前面的夏因-达尔加诺序列(Shine-Dalgarno-Sequence)或其变体。
技术实现思路
在本文中报道了一种多肽原,其可用于在原核细胞中表达目标多肽。因此,所述多肽原融合到目标多肽的N-端。在本文中报道的多肽原提供提高的表达产量,并改善融合多肽的处理(下游加工、纯化)。例如,当使包含所述多肽原的目标蛋白例如与亲和色谱材料结合时,实现有效的内毒素除去。此后,通过用相关蛋白酶切割掺入的蛋白酶切割位点,可以从目标多肽有效地切掉所述多肽原。作为一个方面,在本文中报道了一种多肽原,所述多肽原在N端至C端方向包含-具有氨基酸序列GS的第一个二肽,-氨基酸序列标签, -具有氨基酸序列GS的第二个二肽,其紧邻-酶切割位点。在一个实施方案中,所述多肽原包含前导氨基酸序列,所述前导氨基酸序列在具有氨基酸序列GS的第一个二肽的N-端。在另一个实施方案中,所述前导氨基酸序列具有至少2个氨基酸残基且最多20个氨基酸残基的长度。在另一个实施方案中,所述前导氨基酸序列具有至少2个氨基酸残基且最多10个氨基酸残基的长度。在另一个实施方案中,所述前导氨基酸序列是具有选自SEQ ID NO :1-8的氨基酸序列的多肽。在另一个实施方案中, 所述前导氨基酸序列是具有选自SEQ ID NO :1-6的氨基酸序列的多肽。在一个实施方案中,所述多肽原在N端至C端方向由下述元件组成-前导氨基酸序列,-具有氨基酸序列GS的第-一个二二肽,-氨基酸序列标签,-具有氨基酸序列GS的第—二个二二肽,其紧邻-酶切割位点。在本文中报道的另一个方面是,一种融合多肽,其在N端至C端方向包含-任选的前导氨基酸序列,-具有氨基酸序列GS的第-一个二二肽,-氨基酸序列标签, -具有氨基酸序列GS的第—二个二二肽,其紧邻-酶切割位点,和-目标蛋白。在前文报道的所有方面的一个实施方案中,所述氨基酸序列标签具有选自NO :9至SEQ ID NO :27的氨基酸序列。在一个实施方案中,所述氨基酸序列标签具有SEQ ID N0:11或SEQ ID NO :15的氨基酸序列。在另一个实施方案中,所述酶切割位点具有选自SEQ ID NO :28-42的氨基酸序列。在另一个实施方案中,所述目标多肽选自抗体重链或轻链、抗体片段、单链抗体、载脂蛋白、载脂蛋白变体、载脂蛋白融合体、干扰素、白介素、胰岛素、组织型纤溶酶原激活物变体、集落刺激因子、生长激素、骨形态发生蛋白。在一个实施方案中,所述目标多肽具有SEQ ID N0:43或SEQ ID NO :44或SEQ ID NO :45的氨基酸序列。在一个实施方案中,所述目标多肽是不同于在本文中报道的多肽原的多肽,即所述目标多肽不包含这样的氨基酸序列所述氨基酸序列对应于与氨基酸序列标签直接融合的具有氨基酸序列GS的二肽。在一个实施方案中,在目标多肽的N-端处的氨基酸在下游加工以后具有游离的α-氨基。在一个实施方案中,所述多肽原和/或所述目标多肽没有被糖基化。作为另一个方面,在本文中报道了一种用于生产目标多肽的方法,所述方法包括下述步骤a)提供细胞,所述细胞包含编码融合多肽的核酸,所述融合多肽在N端至C端方向包含-任选的前导氨基酸序列,-第一个二肽GS,-氨基酸序列标签,-第二个二肽GS,其紧邻-酶切割位点,和-目标多肽,b)培养所述细胞,c)从所述细胞或培养基回收所述融合多肽,d)纯化所述融合多肽,e)酶促切割所述融合多肽,并由此生成目标多肽。在一个实施方案中,所述细胞是原核细胞。在另一个实施方案中,所述细胞是大肠杆菌(E. coli)细胞或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞。在一个实施方案中,所述氨基酸序列标签具有选自SEQ ID NO :9至SEQID NO :27的氨基酸序列。在一个实施方案中,所述氨基酸序列标签具有SEQ ID N0:11或SEQ ID NO :15的氨基酸序列。在另一个实施方案中,所述酶切割位点具有选自SEQ ID NO :28-42的氨基酸序列。在另一个实施方案中,其它多肽选自抗体重链或轻链、抗体片段、单链抗体、载脂蛋白、载脂蛋白变体、载脂蛋白融合体、干扰素、白介素、胰岛素、组织型纤溶酶原激活物变体、集落刺激因子、生长激素、 骨形态发生蛋白。在一个实施方案中,所述目标多肽具有SEQ ID N0:43或SEQ ID NO 44 或SEQ ID NO :45的氨基酸序列。在一个实施方案中,所述目标多肽是不同于在本文中报道的多肽原的多肽,即所述其它多肽不包含与氨基 酸序列标签直接融合的具有氨基酸序列GS 的二肽。作为另一个方面,在本文中报道了试剂盒,所述试剂盒包括核酸,所述核酸在5 ’至 3’方向包含-一种核酸,其编码具有氨基酸序列GS的二肽,-一种核酸,其编码氨基酸序列标签,-一种核酸,其编码具有氨基酸序列GS的二肽,所述核酸紧邻-一种核酸,其编码酶切割位点。在本文中报道的一个方面是,一种培养原核细胞的方法,其特征在于,-在培养基中培养所述细胞,所述培养基包含葡萄糖、酵母提取物、L-亮氨酸、 L-脯氨酸、L-甲硫氨酸、盐酸硫胺素、消泡剂,-给所述细胞供给第一补料溶液,所述第一补料溶液包含酵母提取物、甘油、L-甲硫本文档来自技高网
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.08.30 EP 10008996.0;2010.10.15 EP 10187663.91.一种多肽原,所述多肽原在N端至C端方向包含-第一个二肽GS,-氨基酸序列标签,-第二个二肽GS,其紧邻,-酶切割位点。2.根据权利要求1所述的多肽原,其特征在于,所述多肽原包含在第一个二肽GS的N-端的长度为至少2个氨基酸残基的前导氨基酸序列。3.一种融合多肽,其在N端至C端方向包含-根据权利要求1-2中任一项所述的多肽原,和 -目标多肽。4.根据权利要求3所述的融合多肽,其特征在于,在根据权利要求1-3中任一项所述的多肽原的N-端处的氨基酸具有游离的α-氨基。5.根据前述权利要求中任一项所述的多肽,其特征在于,所述氨基酸序列标签具有SEQ ID NO : 11或SEQ ID NO 15的氨基酸序列。6.根据前述权利要求中任一项所述的多肽,其特征在于,所述酶切割位点具有SEQID NO :33或SEQ ID NO 34的氨基酸序列。7.根据权利要求2-6中任一项所述的多肽,其特征在于,在第一个二肽GS的N-端的前导氨基酸序列具有选自SEQ ID NO 01-08的氨基酸序列。8.根据权利要求3-7中任一项所述的融合多肽,其特征在于,所述目标多肽选自抗体重链或轻链、抗体片段、单链抗体、载脂蛋白、载脂蛋白变体、载脂蛋白融合体、干扰素、白介素、胰岛素、组织型纤溶酶原激活物变体、集落刺激因子、生长激素或骨形态发生蛋白。9.根据权利要求3-7中任一项所述的融合多肽,其特征在于,所述目标多肽具有SEQ ID NO 43 或 SEQ ID NO 44 或 SEQ ID NO 45 的氨基酸序列。10.用于生产目标多肽的方法,所述方法包括下述步骤a)提供细胞,所述细胞包含编码融合多肽的核酸,所述融合多肽在N端至C端方向包含-第一个二肽GS,-氨基酸序列标签,-第二个二肽GS,其紧邻,-酶切割位点,和 -所述目标多肽,b)培养所述细胞,c)从所述细胞或培养基回收所述融合多肽,d)纯化所述融合多肽,e)酶促切割所述融合多肽,并由此产生目标多肽。11.根据权利要求10所述的方法,其特征在于,所述融合多肽包含在第一个二肽GS 的N-端的长度为至少2个氨基酸残基的前导氨基酸序列。12.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,在第一个二肽GS的N-端的前导氨基酸序列具有选自SEQ ID NO 01~08的氣基酸序列。13.根据权利要求10-12中任一项所述的方法,其特征在于,所述细胞是原核细胞。14.根据权利要求10-13中任一项所述的方法,其特征在于,所述氨基酸序列标签具有 SEQ ID NO : 11或SEQ ID NO 15的氨基酸序列。15.根据权利要求10-14中任一项所述的方法,其特征在于,所述酶切割位点具有SEQ ID NO :33或SEQ ID NO 34的氨基酸序列。16.根据权利要求10-15中任一项所述的方法,其特征在于,所述目标多肽选自抗体重链或轻链、抗体片段、单链抗体、载脂蛋白、载脂蛋白变体、载脂蛋白融合体、干扰素、白介素、胰岛素、组织型纤溶酶原激活物变体、集落刺激因子、生长激素或骨形态发生蛋白。17.根据权利要求10-15中任一项所述的方法,其特征在于,所述多肽具有SEQID NO: 43或SEQ ID NO 44或SEQ ID NO 45的氨基酸序列。18.试剂盒,其包含核酸,所述核酸在5’至3’方向包含-编码二肽GS的核酸,-编码氨基酸序列标签的核酸,-编码二肽GS的核酸,其紧邻 -编码酶切割位点的核酸。19.一种用于培养原核细胞的方法,其特征在于,-在培养基中培养所述细胞,所述培养基包含葡萄糖、酵母提取物、L-亮氨酸、L-脯氨酸、L-甲硫氨酸、盐酸硫胺素、消泡剂,-给所述细胞供给第一补料溶液,所述第一补料溶液包含酵母提取物、甘油、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸和L-脯氨酸,-给所述细胞供给第二补料溶液,所述第二补料溶液包含L-脯氨酸,-使用氢氧化钾溶液和葡萄糖溶液进行PH控制...

【专利技术属性】
技术研发人员:阿德尔伯特·格罗斯曼弗里德里克·黑塞埃哈德·科佩茨基维尔马·劳克里斯蒂安·尚茨
申请(专利权)人:霍夫曼拉罗奇有限公司
类型:
国别省市:

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