一种测定降钙素原的试剂及该试剂的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种测定降钙素原的试剂及其制备方法。目的是提供的提供的试剂具有准确度高的特点；提供的试剂制备方法具有制作方便的特点。技术方案是：一种测定降钙素原的试剂，包括以下成份：a、降钙素原试剂1；b、降钙素原试剂2；c、液体型降钙素原参考校准品；一种测定降钙素原试剂的制备方法，按如下步骤进行：1）降钙素原试剂1：混合均匀；2）降钙素原试剂2：（1）取悬浮液；（2）混合物反应；（3）得羧基胶乳微球悬浮液；（4）调整浓度；（5）取（3）中的悬浮液加入（4）中；（6）反应；（7）加入乙醇胺；（8）离心处理；3）液体型降钙素原参考校准品：按配方量混合，按降钙素原含量排列或在混合液中加入降钙素原纯品。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，特别是采用胶乳增强免疫比浊法测定血清或血浆中的检测降钙素原的试剂及制备方法，可广泛应用在医学及生物化学

技术介绍
血清降钙素原(Procalcitionin，PCT)是由116个氨基酸组成，分子量为13KD的糖蛋白。其半衰期为25-30小时。健康人血浆PCT含量极低，在正常人血中低于0. 5ng/ml。当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的水平升高；而自身的免疫、过敏和在局部感染、病毒感染、慢性非特异性炎症、癌症发热、移植物宿主排斥反应等疾病时PCT水平不会升高；这就决定了 PCT的高度特异性，因此也可用于各种临床情况的鉴别诊断。PCT浓度和炎症严重程度成正相关，并随着炎症的控制和病情的缓解而降低至正常水平，因而PCT又可作为判断病情与预后以及疗效观察的可靠指标。PCT可在感染后2个小时后检测到，对临床早期诊断具有重要意义，在感染后12 24小时达到高峰。PCT在临床上具有广泛而又重要的应用价值；并且对ICU病人的死亡率及住院时间提供标准。目前检测PCT常用的实验室方法有放射免疫学分析法(RIA)、化学发光免疫分析法(CLIA)、胶体金比色法(GICA)和酶联免疫法(ELISA)，放射免疫学分析法是利用人工合成的多克隆抗体特异地识别和连接合成氨基酸降钙素原。该方法能检测正常人的血清PCT，可靠敏感度为4pm/mL，检测的是游离PCT、结合型PCT和降钙素基因相关肽前体的混合物，而不能区分上述三种物质。该法检测耗时长(19 22h)，而且有放射性元素的污染，标记物稳定性差，废弃物难以处理而使其受到限制。化学发光免疫分析法(CLIA)是利用化学发光物质经催化剂催化和氧化剂氧化，形成一个激发态的中间体；这种激发态的中间体回到稳定基态时，发出光子，利用发光信号测量仪测量光子数，从而间接测定PCT的浓度。目前市场上有管式和板式两种试剂盒，但此法存在吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺直接标记抗体的发光效率低，标记物不稳定的缺点；而且这种直接标记法属于瞬间发光型，很难保证测试结果的稳定性和重复性，还需要特殊的检测仪器。不便于常规实验室开展。而利用生物素-亲和素系统检测PCT的电化学发光免疫试剂盒，需要配套昂贵的全自动电化学发光检测仪，常规实验室无法开展，而且给患者带来不必要的费用，增加患者负担。酶联免疫法是用人工合成的PCT单克隆抗体检测，方法虽特异，但是检测最低限为IOy g/L，对正常人血清中的PCT浓度无法检测出来。中国专利(申请号201110210250. 4)还公开了一种检测降钙素原的试剂盒，利用磁微粒偶联抗体作为固定分离相，生物素-链霉亲和素多级放大体系，用辣根过氧化物酶为催化酶催化发光底物，虽然提高了检测的灵敏度，但是整个反应耗时也较长(至少需要40分钟)，而且样本需要磁性分离预处理。该法需要洗涤反应管，如果是人工洗涤会带来人为误差，如果用仪器洗，则需要另备洗涤仪器，增加实验室的成本
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服上述
技术介绍
的不足，提供一种降钙素原检测试剂及制备方法；所提供的试剂应具有准确度高、重复性好、操作简单、测定时间短、适用于各种类型的全自动生化分析仪的特点；所提供的试剂制备方法应具有制作方便以及成本不高的特点。本专利技术提供的技术方案是一种测定降钙素原的试剂，包括以下成份及含量a、降钙素原试剂1:缓冲液10-400mmol/L pH 位为 5-10 I Li 解质10-400mmol/L 表面活性剂0. 01-10g/L 反应加速剂0.01-50g/L 防腐剂2-3 mmol/L 稳定剂4-5 mmol/L 其余是纯化水该试剂I的pH值为7. 0-8. 0 ；b、降钙素原试剂2: 抗人PCT抗体胶乳颗粒0. 0001-0. 05 mg/ml缓冲液50mmol/L pH 值为 6.0-8.5 防腐剂2-3mmol/L 稳定剂3-4mmol/L 其余是纯化水；所述抗人PCT抗体胶乳颗粒中的羧基胶乳微球的粒径为20nm-500nm ；C、液体型降钙素原参考校准品缓冲液100-300irimo!/L pH 值为 7.2-8.0防腐剂2-3mmol/L 稳定剂160-17Ommo I /L 降钙素原适量 其余是纯化水；所述液体型降钙素原参考校 准品包括形成系列浓度的5份参考校准品；5份参考校准品中的降I丐素原含量由低到高分别为1. 25ng/ml、2. 5ng/ml、5. 0ng/ml、10. Ong/ml、20. Ong/ml ;或者，制备成单点浓度的降钙素原参考校准品；例如浓度为100ng/ml或500ng/ml的降钙素原参考校准品。所述缓冲液是磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、1，4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)缓冲液、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-1乙烷磺酸(HEPES)缓冲液、三羟甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)缓冲液、2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液中的一种或两种以上任意比例的混合。所述降钙素原试剂I中缓冲液的浓度为20-200mmol/L，pH值7. 0-8. O。所述反应加速剂是聚乙二醇或硫酸葡聚糖(DS-50 )。所述反应加速剂浓度优选0. 05_30g/L。所述稳定剂是乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白、氯化钠中的一种或两种以上任意比例的混合。所述电解质是阴离子电解质或阳离子电解质。所述电解质是阳离子中的氯化钠(NaCl )，浓度优选50-200mmol/L。所述表面活性剂是非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性离子表面活性剂。所述非离子表面活性剂是Theist、Tween系列、聚氧乙烯月桂醚系列、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚中的一种或两种以上任意比例的混合。所述表面活性剂浓度优选0. 5-lg/L。所述抗人PCT抗体胶乳颗粒的浓度优选L 0-10mg/mlo所述抗人降钙素原抗体是羊抗人降钙素原抗体或兔抗人降钙素原抗体或鸡抗人降钙素原抗体或鼠抗人降钙素原抗体。一种测定降钙素原试剂的制备方法，按如下步骤进行I)降钙素原试剂1:按配方量将缓冲液、电解质、表面活性剂、反应加速剂、防腐剂、稳定剂以及纯化水混合均匀，调定PH值至7. 0-8. 0 ；2)降钙素原试剂2:(I)取羧基胶乳微球用缓冲液稀释成0. 01mg/ml的悬浮液；(2)按Iml的羧基胶乳微球悬浮液加20mgl_乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDAC羧基活化剂)和40mg的N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(NHS)的比例，加入1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐，立即混匀后在室温将此混合物反应15-30分钟，不断搅拌；(3)用缓冲液或纯化水洗涤羧基胶乳微球，除去未反应的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐，并将胶乳微球在纯化水中悬浮得羧基胶乳微球悬浮液，使其浓度为0. 01mg/ml ；(4)将抗人降钙素原抗体溶于缓冲液中，使抗人降钙素原抗体的蛋白质浓度为0. 25mg/ml 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定降钙素原的试剂，包括以下成份及含量：a、降钙素原试剂1：该试剂1的pH值为7.0?8.0；b、降钙素原试剂2：所述抗人PCT抗体胶乳颗粒中的羧基胶乳微球的粒径为20nm?500nm；c、液体型降钙素原参考校准品：所述液体型降钙素原参考校准品包括形成系列浓度的5份参考校准品；5份参考校准品中的降钙素原含量由低到高分别为1.25ng/ml、2.5ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml、20.0ng/ml；或者，制备成单点浓度的降钙素原参考校准品。FDA00002572064100011.jpg,FDA00002572064100012.jpg,FDA00002572064100013.jpg

【技术特征摘要】
1.一种测定降钙素原的试剂，包括以下成份及含量a、降钙素原试剂1:缓冲液10-400mmol/L pH ' 为 5-10ijl 解成10-400mmol/L表而活性剂O. Ol-lOg/L反应加速剂0.01-50g/L防腐剂2-3mmol/L稳定剂4-5 mmol/L其余是纯化水该试剂I的PH值为7. 0-8. O ；b、降钙素原试剂2:抗人PCT抗体胶乳颗粒O. 0001-0. 05 mg/ml缓冲液50_ol/L pH 值为 6.0-8.5防腐剂2_3mmol/L稳定剂3-4mmol/L其佘是纯化水；所述抗人PCT抗体胶乳颗粒中的羧基胶乳微球的粒径为20nm-500nm ；C、液体型降钙素原参考校准品缓冲液100-30()mmol/L pH 侦为 7.2-8.0防腐剂2-3mmol/L稳定剂160-170mmol/L降钙素原适量其余足纯化水；所述液体型降钙素原参考校准品包括形成系列浓度的5份参考校准品；5份参考校准品中的降I丐素原含量由低到高分别为1. 25ng/ml、2. 5ng/ml、5. 0ng/ml、10. 0ng/ml、20. Ong/ml ;或者，制备成单点浓度的降钙素原参考校准品。2.根据权利要求1所述的一种测定降钙素原的试剂，其特征在于所述缓冲液是磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、1，4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)缓冲液、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-1乙烷磺酸(HEPES)缓冲液、三羟甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)缓冲液、2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液中的一种或两种以上任意比例的混合。3.根据权利要求2所述的一种测定降钙素原的试剂，其特征在于所述降钙素原试剂I中缓冲液的浓度为20-200mmol/L，pH值7. 0-8. O。4.根据权利要求3所述的一种测定降钙素原的试剂，其特征在于所述反应加速剂是聚乙二醇或硫酸葡聚糖。5.根据权利要求4所述的一种测定降钙素原的试剂，其特征在于所述电解质是阴离子电解质或阳离子电解质。6.根据权利要求5所述的一种测定降钙素原的试剂，其特征在于所述表面活性剂是非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性离子表面活性剂；所述非离子表面活性剂是Theist、Tween系列、聚氧乙烯月桂醚系列、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚中的一种或两种以上任意比例的混合。7.根据权利要求6所述的一种测定降钙素原的试剂，其特征在于所述稳定剂是乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白、氯化钠中的一种或两种以上任意比例的混合。8.根据权利要求7所述的一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈开华，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：元升生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：