用于检测甲型肝炎病毒抗体的方法、检测用的试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及生物学技术领域，具体涉及一种用于检测甲型肝炎病毒抗体的方法、采用此方法进行检测的试剂盒、以及该试剂盒的制备方法，将抗人IgM与抗人IgG分别固定在膜上，加入待检血清，待检血清中的甲肝抗体和固定到膜上的抗人IgM与抗人IgG结合后，加入酶标记甲肝抗原溶液，最后加入显色液显色显示结果。本发明专利技术可以消除样本中类风湿因子对结果的假阳性干扰，并使酶标甲肝抗原的过程更加快速高效，同时降低试剂盒的抗体成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物学
，具体涉及一种检测甲型肝炎病毒抗体的方法、采用此方法进行检测的试剂盒、以及该试剂盒的制备方法。
技术介绍
甲型病毒性肝炎，简称甲型肝炎、甲肝，是由甲型肝炎病毒(HAV)引起的，以肝脏炎症病变为主的传染病，主要通过粪-口途径传播，临床上以疲乏，食欲减退，肝肿大，肝功能异常为主要表现，部分病例出现黄疸，主要表现为急性肝炎，无症状感染者常见。甲型肝炎患者粪便中带有病原体HAV，可通过污染水和食物进行传播。因此对甲型肝炎病毒的检测 可作为一项预防措施，防止疾病的传播。目前对甲型肝炎病毒检测的主要方法是甲型肝炎病毒特异性抗体的检测，其中通过抗HAV IgM判定是否现症感染，检测HAV IgG判定既往感染。检测两种抗体有利于对被检对象进行全面判定。甲肝抗体的全面检测不仅为临床诊断提供依据，还能有效地筛选献血员，减少医源性甲型肝炎的发生和传播，同时能减少检测人员的工作量，节约成本，减少采血量,减少患者痛苦。目前临床上多采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HAVIgM抗体。其原理为目前最为常用的IgM抗体检测方法——捕获法，即以抗人IgM抗体(抗人μ链)作为固相抗体，血清中的IgM类抗体(特异的和非特异的)可被固相抗体捕获，再加入特异抗原，其与固相上捕获的IgM抗体结合后，加入酶标抗HAV抗体，最后加底物显色。但此方法存在以下问题(I)每一批试验从加样、温育及洗板等步骤较多，操作繁琐，时间较长，且需专门操作人员及专用仪器，难以在基层医疗单位开展。(2)检测中需分别加入显色成分A液与B液，一定程度上增加了劳动强度与试剂盒成本。专利申请号200710075306. 3公开了一种可在一定时间使生色物与过氧化物内共存的显色体系，但此体系中的关键组分一生色物保护剂硫代硫酸钠，在此专利技术的pH低于6. O的酸性环境下不利于长期的稳定,溶液体系若存在CO2、微生物或长期暴露在光照环境下也都不利于硫代硫酸钠的稳定，因此不能对生色物如TMB等起到有效的抗氧化保护作用。其中用于吸收紫外线的巴松-1789虽可以起到对紫外线的防护作用，但它遇金属离子即变红，干扰试验结果，因此增加了配制过程中对试剂纯度及操作的额外要求。(3)对甲肝IgM等进行检测的捕获法易受RF (IgM类)及其他非特异IgM的干扰[I]。RF (IgM类)能与固相抗人μ链抗体结合，并可与随后加入的酶标抗体(动物IgG)反应，从而导致假阳性反应，致使检测质量不能很好地得到保证。且ELISA法无法做到对两种抗体的快速同时检测；个别胶体金法可对两种抗体同时检测，但由于方法学限制，灵敏度不是很高。目前利用辣根过氧化物酶(以下简称HRP)标记抗体技术已比较成熟，尤其是普遍采用的过碘酸钠法，少数学者利用HRP标记抗原的技术过程与标记抗体过程基本类似，例如专利申请号200810141799. O中提到了利用酶标抗体的方法标记了甲肝重组抗原。但此标记过程存在以下问题(I)标记中需反复调节pH，且pH值调节范围较宽，不可避免地影响酶活性；(2)标记过程繁琐、操作耗时；(3)标记过程中不可避免发生酶自身的交联；(4)标记物不够稳定不易保存，反复冻融又会使标记物活性下降。因此，以此传统标记方法制备的甲肝检测试剂盒的质量与稳定性不能得到保证。目前常规的酶标记物稀释缓冲液对酶标记物不能起到最大限度的保护作用，浓度较高的酶标记物在低温下相对稳定，但制备工作液时需复溶或再稀释，稀释后保存期较短，且增加了工作量。专利申请号200910143637. 5公开了一种维护酶标记物稳定性的稀释液，但此溶液系统中所添加的木糖是一种带有醛基的还原性糖，同时此系统中还存在大量带有氨基基团的甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、酶及其其它生物分子，此种混合溶液中易发生美拉德反应一即羰基化合物(还原糖类)和氨基化合物(氨基酸和蛋白质)间的反应，经过复杂的历程最终生成棕色甚至是黑色的大分子物质类黑精或称拟黑素，所以又称羰胺反应(法国化学家L. C. Maillard在1912年提出)。美拉德反应在高温条件下进行较快，但在长期室温储存条件下也可以缓慢进行这种非酶促反应；且此稀释液诸多添加物都是动物源性，使用非 动物源性的稳定剂以减少动物源性原辅料的潜在危害已引起生产厂家的广泛关注。因此以上保护性稀释液不利于长期保存酶标记物。某些诊断试剂盒的保存缓冲液出于商业原因等并未给出具体组分，给试剂盒的开发应用带来不便。因此应根据酶标抗原的分子量、酸碱性质、疏水性等寻找有效的保存缓冲液。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种用于检测甲型肝炎病毒抗体的方法、试剂盒及其制备方法，以消除样本中类风湿因子对结果的假阳性干扰，并使酶标甲肝抗原的过程更加快速高效，延长酶标记物及试剂盒的有效期，同时降低试剂盒的抗体成本。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是一种用于检测甲型肝炎病毒抗体的方法，将抗人IgM与抗人IgG分别固定在膜上，加入待检血清，待检血清中的甲肝抗体和固定到膜上的抗人IgM与抗人IgG结合后，加入酶标记甲肝抗原溶液，最后加入显色液显色显示结果；所述酶标记甲肝抗原溶液采用辣根过氧化物酶标记甲肝抗原溶液，并采用以下步骤制备(I)将Ig辣根过氧化物酶溶于25ml 30ml的O. OlM磷酸盐缓冲液中，加入70 85mg乙二胺，用O.1M盐酸将pH值调节至5. 0，所得溶液再与115 125mgl-乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐混合，室温振荡反应后，采用O. OlM磷酸盐缓冲液对所得溶液进行透析，制得氨基化辣根过氧化物酶溶液；(2)将步骤(I)制得的溶液配制成1ml、浓度为5 5. 2mg/ml的氨基化辣根过氧化物酶溶液，再向所得溶液内加入60 85 μ I交联剂，混匀后于室温下反应25 35min ；(3)将所述反应物加入截留分子量为IOK的超滤管，并对反应物进行离心处理8 12min，再以O. OlM的磷酸盐缓冲液复溶滞留结合物至1ml，再以同样离心力离心8 12min,以除去过量的交联剂，并再次复溶滞留物至Iml ；(4)加入800 1000 μ I浓度为lmg/ml的甲肝抗原溶液，并于室温下反应25 35min ；(5)使步骤(4)制得的溶液通过SephadexG-200层析柱,收集第一峰的产物，即为酶标甲肝抗原溶液。优选的，所述膜为硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜。优选的，所述辣根过氧化物酶标记甲肝抗原所用交联剂分子结构如下本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测甲型肝炎病毒抗体的方法，其特征在于：将抗人IgM与抗人IgG分别固定在膜上，加入待检血清，待检血清中的甲肝抗体和固定到膜上的抗人IgM与抗人IgG结合后，加入酶标记甲肝抗原溶液，最后加入显色液显色显示结果；所述酶标记甲肝抗原溶液采用辣根过氧化物酶标记甲肝抗原溶液，并采用以下步骤制备：（1）将1g辣根过氧化物酶溶于25ml～30ml的0.01M磷酸盐缓冲液中，加入70～85mg乙二胺，用0.1M盐酸将pH值调节至5.0，所得溶液再与115～125mg1?乙基?(3?二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐混合，室温振荡反应后，采用0.01M磷酸盐缓冲液对所得溶液进行透析，制得氨基化辣根过氧化物酶溶液；（2）将步骤（1）制得的溶液配制成1ml、浓度为5～5.2mg/ml的氨基化辣根过氧化物酶溶液，再向所得溶液内加入60～85μl交联剂，混匀后于室温下反应25～35min；（3）将所述反应物加入截留分子量为10K的超滤管，并对反应物进行离心处理8～12min，再以0.01M的磷酸盐缓冲液复溶滞留结合物至1ml，再以同样离心力离心8～12min，以除去过量的交联剂，并再次复溶滞留物至1ml；（4）加入800～1000μl浓度为1mg/ml的甲肝抗原溶液，并于室温下反应25～35min；（5）使步骤（4）制得的溶液通过SephadexG?200层析柱，收集第一峰的产物，即为酶标甲肝抗原溶液。...

【技术特征摘要】
1.一种用于检测甲型肝炎病毒抗体的方法，其特征在于将抗人IgM与抗人IgG分别固定在膜上，加入待检血清，待检血清中的甲肝抗体和固定到膜上的抗人IgM与抗人IgG结合后，加入酶标记甲肝抗原溶液，最后加入显色液显色显示结果； 所述酶标记甲肝抗原溶液采用辣根过氧化物酶标记甲肝抗原溶液，并采用以下步骤制备 (1)将Ig辣根过氧化物酶溶于25ml 30ml的0.OlM磷酸盐缓冲液中，加入70 85mg乙二胺，用0.1M盐酸将pH值调节至5. 0，所得溶液再与115 125mgl-乙基_ (3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐混合，室温振荡反应后，采用0. OlM磷酸盐缓冲液对所得溶液进行透析，制得氨基化辣根过氧化物酶溶液； (2)将步骤(I)制得的溶液配制成1ml、浓度为5 5.2mg/ml的氨基化辣根过氧化物酶溶液，再向所得溶液内加入60 85iU交联剂，混匀后于室温下反应25 35min ； (3)将所述反应物加入截留分子量为IOK的超滤管，并对反应物进行离心处理8 12min，再以0. OlM的磷酸盐缓冲液复溶滞留结合物至1ml，再以同样离心力离心8 12min,以除去过量的交联剂，并再次复溶滞留物至Iml ； (4)加入800 1000ill浓度为lmg/ml的甲肝抗原溶液，并于室温下反应25 35min ； (5)使步骤(4)制得的溶液通过SephadexG-200层析柱，收集第一峰的产物，即为酶标甲肝抗原溶液。2.如权利要求1所述的用于检测甲型肝炎病毒抗体的方法，其特征在于，所述膜为硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜。3.如权利要求1所述的用于检测甲型肝炎病毒抗体的方法，其特征在于，所述辣根过氧化物酶标记甲肝抗原所用交联剂分子结构如下4.如权利要求1所述的用于检测甲型肝炎病毒抗体的方法，其特征在于，所述显色液为包括四甲基联苯胺、过氧化脲、抗氧化剂绿原酸、还原剂抗坏血酸、紫外线吸收剂2-氰基-3，3- 二苯基丙烯酸异辛酯和pH5. 0的乙酸钠缓冲溶液体系。5.如权利要求4所述的用于检测甲型肝炎病毒抗体的方法，其特征在于，所述显色液采用如下方法制得 ⑴将8. 3 8. 5g三水合乙酸钠晶体溶于600ml超纯水中，振荡混匀，并调整溶液pH至.5.0 ； ⑵再将0. 4 1. Og四甲基联苯胺溶于3ml无水乙醇中，制得四甲基联苯胺乙醇溶液； ⑶将上述两种溶液混合，振荡混匀； ⑷分别将70 90mg绿原酸与70 90mg抗坏血酸、8 12ml2_氰基-3，3- 二苯基丙烯酸异辛酯、2. 5 2. 9g磷酰甘氨酸及0. 2 0. 8g过氧化脲加入到步骤(3)所得到的混合溶液中，振荡混匀，得到所述显色液。6.如权利要求1所述的用于检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨致亭，杨金红，武新清，王爱法，沈孝功，刘济宁，丁建华，夏安春，
申请(专利权)人：青岛汉唐生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：