本发明专利技术涉及葡萄藻开发利用的技术，旨在提供一种荧光光谱法测定葡萄藻脂质含量的前处理及测定方法。该方法是将待测葡萄藻液置于离心管，加入微粒型的黄单胞多糖，然后置于冰水浴中，并用超声波将由几十至上百个细胞形成的葡萄藻集落制备成均匀分布的单细胞或几个细胞的聚集体，以满足荧光光谱测定法对被测藻液均匀度的要求。本发明专利技术方法具有藻液用量少、灵敏度高、稳定性好、省时省力，且可实现高通量测量等优点，可为葡萄藻育种和培养等研发提供必要的技术方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于能源微藻一葡萄藻开发利用的技术，特别涉及一种利用荧光光谱法测定葡萄藻脂质含量的方法。
技术介绍
葡萄藻(Botryococcus)属绿藻门(Chlorophyta)、共球藻纲(Chlorophceae)、绿球藻目(Chlorococcales),葡萄藻科(Botryococcaeae),是一种世界广布的能源微藻。该属中的布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)因脂质的含量高(可达细胞干重85% )、且组成和结构与化石原油相近，而被誉为“油藻”，以其生产航空燃油等高品质燃料一直是近年来全球生物能源领域的研发热点之一 [Metzger & Largeau. Botryococcus brauni1: a richsource for hydrocarbons and related ether lipids. Appl Microbiol Biotechnol.2005, 66: 486 - 496]。建立快速、微量、可靠的脂质含量检测技术是开展葡萄藻等微藻种质改良和培养模式优化等研发的重要基础，国内外已将尼罗红荧光法成功地用于小球藻等微藻的脂质含量快速检测[王金娜等.产油微藻的筛选及中性脂动态积累过程的检测.生物物理学报.2010，26 (6) : 472-480]。但值得指出的是，葡萄藻细胞不像小球藻等微藻细胞那样以游离的单细胞形式存在，而通常是由几十至上百个细胞形成集落。这种集落状的细胞团因体积大且易于下沉而难以在培养液中均匀分布，从而严重影响应用尼罗红荧光法检测其脂质含量的可行性与准确性。正因如此，目前在葡萄藻研发中仍多沿用传统的干重法检测其脂质含量，这也是导致多年来国内外葡萄藻育种、培殖和深加工等方面研发进展缓慢的重要原因之一 [Yarning Ge, et al. Growth characteristics of Botryococcusbraunii 765 under high CO2 concentration in photobioreactor. BioresourceTechnology. 2011，102(1) : 130 - 134]。因此，迫切需要建立一种方法，能将集落状的葡萄藻细胞团制备成能均匀分布的单细胞或由几个细胞组成的小细胞团，以满足荧光光度测定法对样品的要求，从而将具快速、微量、可靠的尼罗红荧光脂质含量检测技术用于葡萄藻的研究与开发。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，建立一种。为解决技术问题，本专利技术的解决方案是提供一种荧光光谱法测定葡萄藻脂质含量的样品前处理方法，其特征在于，该方法是将待测葡萄藻液置于离心管，加入微粒型的黄单胞多糖(Xanthan gum)，然后置于冰水浴中，并用超声波将由几十至上百个细胞形成的葡萄藻集落制备成均匀分布的单细胞或几个细胞的聚集体，以满足荧光光谱测定法对被测藻液均匀度的要求。该方法具体包括以下步骤(I)取4 mL待测葡萄藻液于5 mL离心管中，再加入适量微粒型黄单胞多糖，并置于冰水浴中预冷；(2)预冷藻液经超声波处理10 s后，在光学显微镜下观察葡萄藻集落是否已被分散成单细胞或2-5个细胞的聚集体；(3)若没有，则可用每次5 s的超声波进行多次处理，直至被分散成单细胞或2-5个细胞的聚集体，由此可计算被测葡萄藻液适宜的超声处理时间T=10+5*n，单位为S，其中η为每超声处理5 s的次数。所述微粒型黄单胞多糖的添加量为5粒,0. 2 mg/粒,共I mg。本专利技术进一步提供了基于前述方法的荧光光谱法测定葡萄藻脂质含量的方法，其过程包括将经过前处理的葡萄藻液加入二甲基亚砜水溶液和尼罗红水溶液，二甲基亚砜辅助尼罗红进入葡萄藻细胞，使胞内脂质与尼罗红生成荧光产物；于490 nm光子激发下检测568 nm的荧光发射光谱，获得被测葡萄藻的荧光发射光强度(I);将所得结果与空白样本 进行比较后，再与油脂标准品——三油酸甘油酯的荧光发射光强度曲线进行比较，通过对应的光强度值得到被测葡萄藻样品中脂质含量。该方法具体包括以下步骤(I)取200 PL经前处理的葡萄藻液于荧光测量皿中，依次加入15%(V/V) 二甲基亚砜水溶液和3 Pg/mL尼罗红溶液各200 μ ，充分混匀后于黑暗中40°C染色10 min，再利用荧光分光光度计于490 nm光子激发下检测568 nm的荧光发射光强度(I);同时，取200KL葡萄藻培养液于另一荧光测量皿中，依次加入15%(V/V) 二甲基亚砜水溶液和3 Pg/mL尼罗红溶液各200 μ ，充分混匀后于黑暗中40°C染色10 min，进而利用荧光分光光度计于490 nm光子激发下检测568 nm的荧光发射光强度(IB)，以此为对照；被测葡萄藻中脂质的相对荧光强度值Is=1-1b ;(2)以三油酸甘油酯为脂质含量测定的标准品，在5个I ml的EP离心管中依次加入200 Pg/mL的三油酸甘油酯DMSO水溶液[DMS0含量为3%(V/V) ] 0、50、100、150和200μ ，并用蒸馏水补齐至200 μ ，依次加入15%(V/V) 二甲基亚砜水溶液和3 Pg/mL尼罗红溶液200 μ ，充分混匀后于黑暗中40°C染色10 min，再利用荧光分光光度计于490 nm光子激发下检测568 nm的相对突光发射光强度值(Ie),以三油酸甘油酯加入量m为横坐标、Ie为纵坐标，作两者的标准曲线，并得到线性拟合方程IK=f(m)；(3)以步骤(I)中测得葡萄藻中脂质的相对荧光强度值Is替代步骤(5)线性拟合方程IK=f(m)中的Ik，通过计算即可求得200 PL被测葡萄藻液中脂质的质量ms (单位为Mg);(4) 200 PL待测葡萄藻液的干藻质量Ms (单位为Pg)可用干重称量法测定，被测葡萄藻的脂质含量C1=(IIiyMs) X 100%。本专利技术中，设定超声波仪的频率为20 kHz，发射功率为100 W，将Φ 2型变幅杆前端2 cm浸入预冷藻液，以I s / I s (开/关)间歇超声处理15 25 S。本专利技术中，3 Kg/mL尼罗红溶液的配制方法为,称取1. 5 mg尼罗红并用5 ml丙酮溶解，再用蒸馏水定容至500 ml。与现有技术相比，本专利技术的显著优点本专利技术方法与传统的干重检测法等方法相比，具有藻液用量少、灵敏度高、稳定性好、省时省力，且可实现高通量测量等优点，可为葡萄藻育种和培养等研发提供必要的技术方法。具体实施例方式利用荧光光谱法测定葡萄藻脂质含量时，要求藻细胞能均匀地分布于培养液中。为将细胞呈集落状的葡萄藻制备成能均匀分布的单细胞或几个细胞的聚集体，本方法用适当功率超声波进行处理，使其尽可能分散。为减少超声波对藻细胞的机械损伤，以及克服葡萄藻细胞的体积和密度比小球藻等微藻细胞的大而易下沉的难题，本方法于超声处理前在藻液中加入少量黄单胞多糖(Xanthan gum),达到了很好的效果。这主要是基于黄单胞多糖具有以下三方面特性(I)它水溶性好、透明无色、性能稳定，在低于O. 5%。浓度时，不影响微藻脂质含量测定；(2)它能在藻细胞表面形成膜状物，且可使超声波能量传递变得更加平缓，从而有助减少超声波对藻细胞造成的机械损 伤；(3)少量黄单胞多糖即可显著增加本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种荧光光谱法测定葡萄藻脂质含量的样品前处理方法，其特征在于，该方法是：将待测葡萄藻液置于离心管，加入微粒型的黄单胞多糖，然后置于冰水浴中，并用超声波将由几十至上百个细胞形成的葡萄藻集落制备成均匀分布的单细胞或几个细胞的聚集体，以满足荧光光谱测定法对被测藻液均匀度的要求。
【技术特征摘要】
1.一种荧光光谱法测定葡萄藻脂质含量的样品前处理方法，其特征在于，该方法是将待测葡萄藻液置于离心管，加入微粒型的黄单胞多糖，然后置于冰水浴中，并用超声波将由几十至上百个细胞形成的葡萄藻集落制备成均匀分布的单细胞或几个细胞的聚集体，以满足荧光光谱测定法对被测藻液均匀度的要求。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤 (1)取4mL待测葡萄藻液于5 mL离心管中，再加入适量微粒型黄单胞多糖，并置于冰水浴中预冷； (2)预冷藻液经超声波处理10s后，在光学显微镜下观察葡萄藻集落是否已被分散成单细胞或2-5个细胞的聚集体； (3)若没有，则用每次5s的超声波进行多次处理，直至被分散成单细胞或2-5个细胞的聚集体，由此可计算被测葡萄藻液适宜的超声处理时间T=10+5*n，单位为S，其中η为每超声处理5 s的次数。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，微粒型黄单胞多糖的添加量为5粒，O.2mg/ 粒,共 I mg。4.一种基于权利要求1所述方法的荧光光谱法测定葡萄藻脂质含量的方法，其特征在于，其过程包括将经过前处理的葡萄藻液加入二甲基亚砜水溶液和尼罗红水溶液，二甲基亚砜辅助尼罗红进入葡萄藻细胞，使胞内脂质与尼罗红生成荧光产物；于490 nm光子激发下检测568 nm的荧光发射光谱，获得被测葡萄藻的荧光发射光强度(I);将所得结果与空白样本进行比较后，再与油脂标准品——三油酸甘油酯的荧光发射光强度曲线进行比较，通过对应的光强度值得到被测葡萄藻样品中脂质含量。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤 (I)取200 PL经前处理的葡萄藻液于荧光测量皿中，依次加入15%(V/V) 二甲基亚砜水溶液和3 Pg/mL尼罗红溶液各200 μ ，充分混匀后于黑暗中40°C染色10 min，再利用荧光分光光度计于490 nm光子激发下检测568 n...
【专利技术属性】
技术研发人员：汪志平，刘新颖，于金鑫，吕蓓芬，马丽芳，陈子元，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。