猪支原体肺炎PCR诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种猪支原体肺炎PCR诊断试剂盒,它包括0.1moL/LPBS，裂解液，DL2000，PCR酶，超纯水，引物，阳性对照及阴性对照；其中引物包括上游引物及下游引物，上游引物的序列为5’-TAGACCAGGATGGACAAGATGAT-3’，下游引物的序列为5’-AACCACAGGACTAAGACGCAACA-3’。本发明专利技术根据GenBank中的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌猪肺炎支原体ompA基因序列，设计了一对引物，通过对PCR反应条件进行优化，研制了检测猪支原体肺炎PCR诊断试剂盒。经过上述的实验结果表明本发明专利技术的试剂盒具有快捷、灵敏、准确、重复性好、保质期长等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及ー种试剂盒，尤其是一种猪支原体肺炎PCR诊断试剂盒。
技术介绍
猪支原体肺炎hyopneumoniaeof swine, MPS)又称猪喘气病,是由猪肺炎支原体hyopneumoniae, Mhp)引起猪的一种高发病率、低死亡率的慢性呼吸道传染病(Straw B E等，1999)。该病在世界上广泛流行和存在，其典型症状是病猪咳嗽、呼吸困难和气喘，主要病变特征是融合性支气管肺炎，在肺的尖叶、心叶、中间叶和膈叶前缘呈“肉样”或“虾肉样”实变。本病仅发生于猪，不同品种、年龄和性别的猪均能感染，其中以哺乳猪和幼猪最易感，发病率和死亡率较高。支原体感染后会出现免疫抑制，且容易继发感染其他传染病，因而对养猪业造成较为严重的经济损失(杨建德等，2002)。Mhp的检测通常是基于病原的分离或免疫荧光实验。近几年，对于Mhp的分离，血清学鉴定和血清抗体监测已发展了许多方法，这些方法尽管在理论上可以广泛应用，但仅有少数条件好的实验室才能做到，因此，ー些非特异性方法仍然是有用的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种猪支原体肺炎PCR诊断试剂盒，它能快速的检测出猪肺炎支原体，并且具有特异、灵敏、准确的特点，为猪支原体肺炎的防制提供科学依据。本专利技术是这样实现的猪支原体肺炎PCR诊断试剂盒，它包括浓度为0.1moL/L 的 PBS40uL,裂解液 250uL, DL2000100uL, PCR 酶 250uL,超纯水 170uL,引物 40uL,阳性对照20uL及阴性对照20uL ;其中引物包括上游引物及下游引物，上游引物及下游引物各20 uL，上游引物的序列为5’ - TAGACCAGGATGGACAAGATGAT _3’，下游引物的序列为5’ -AACCACAGGACTAAGACGCAACA -3'阴性对照为超纯水，共计20 uL。阳性对照为重组pMD18-T_ompA质粒,共计20uL。缓冲液为50mM的Tris-HcL及150mM的NaCL的混合溶液，共计40uL。PCR 酶的组成包括 IOmM 的 Tris_HcL、50mM 的 KCL、1. 5mM 的 MgCL2 以及 0. 05U 的Poymerase/Ul,共计 250uL。裂解液由Tris-HcL50mM、EDTA2mM、NaClIOOmM以及占裂解液总体积5%的SDS组成的混合溶液，250uL。 为了验证本专利技术的效果进行了如下实验 I材料与方法1.1菌株猪肺炎支原体标准株P216购自中国兽医微生物保藏管理中心，猪肺炎支原体活疫苗168株购自南京天邦生物科技有限公司；猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜杆菌、鸡毒支原体、大肠杆菌、鸡肠炎沙门氏菌由贵州省畜禽疫病研究实验室保存。主要试剂Goldview、Tris、EDTA、DL2000、Taq DNA Polymerase (5U/ML)及相应IOXTaq Buffer、dNTP等购自宝生物(大连)工程有限公司；苯酚、氯仿、无水こ醇、支原体培养基为国产试剂。引物设计根据猪肺炎支原体ompA基因序列设计I对特异性引物，由宝生物(大连)工程有限公司合成，上游引物5 ’ -TAGACCAGGATGGACAAGATGAT-3 ’，下游引物5， -AACCACAGGACTAAGACGCAACA-3，。试剂盒组成 (1)0.1moL/L PBS ; (2)裂解液；(3) DL2000 ； (4) PCR 酶；(5)超纯水；(6)引物；(7)阳性对照；(8)阴性对照 1.5猪肺炎支原体核酸的抽提 (I)取待检样品肺、淋巴结、扁桃体等组织样品共约50 mg，加入500 ML PBS缓冲液，待 检样品研磨后一 20°C反复冻融3次12000 r/min离心取上清用于核酸的提取，用酚氯仿法提取猪肺炎支原体DNA。(2)猪肺炎支原体标准株、猪肺炎支原体活疫苗168株、大肠杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜杆菌、鸡毒支原体、鸡肠炎沙门氏菌纯菌液，鼻拭子样品均用煮沸法提取DNA。反应条件的优化 对？0 反应条件，包括退火温度(50で、55で、60で)，引物浓度(5 Mmol/LUO Mmol/L、20Mmol/L), Taq DNA polymerase浓度(0. 5 U、1 U、2 U)进行优化，以确定最佳反应条件，同时以超纯水作为空白对照。PCR反应在25 ML反应体系中进行，IOXTaq Buffer 5ML，dNTPmixture 4ML ;Taq DNA polymerase lML,用超纯水补足至 25 ML。反应条件为94°C 5 min ；94°C I 1^11，退火温度(50で、55で、60°0 1 min,72°C I min，30 个循环；最后 72°C延伸 10min。取7ML PCR扩增产物于10 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。敏感性试验 将提取的猪肺炎支原体标准株核酸用蛋白质核酸仪测定浓度后，进行10倍比稀释后分别进行PCR反应，以确定建立的PCR诊断试剂盒的敏感性。特异性试验 以猪肺炎支原体标准株、猪支原体肺炎活疫苗168株、大肠杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜杆菌、鸡毒支原体、鸡肠炎沙门氏菌进行PCR反应，以确定建立的PCR诊断试剂盒的特异性。重复性试验 应用建立PCR方法，重复检测猪肺炎支原体DNA样品3次以检验结果的可靠性。试剂盒的保存期检测 将试剂盒保存在4°C、一 20°C分别于3月、6月、I年，对阳性样品进行检测，以确定试剂盒的保存时间。试剂盒对临床样品的检测 对2010 2012年贵州省贵阳市、黔南州、铜仁地区、瓮安县几个规模化养猪场和养猪专业户采集的58份病料进行检測。DNA核酸的抽提參照1. 5，同时进行细菌学和生化检验。结果 2.1 PCR产物的鉴定猪肺炎支原体的PCR扩增片段经胶回收，送大连宝生物工程有限公司测序，结果表明，扩增片段分别为猪肺炎支原体的特异性条带。反应条件的优化 PCR反应在25 ML反应体系中最佳反应条件为，退火温度55°C，Taq DNA polymeraselU，引物浓度10 Mmol/L用引物均有效扩增出了其目的片段，片段大小为500 bp，无非特异性片段产生，如图1所示。敏感性试验 PCR反应中，猪肺炎支原体DNA的最低检测量为0. 25 ng/L，如图2所示。特异性试验 以猪肺炎支原体标准株、猪肺炎支原体活疫苗168株、大肠杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜杆菌、鸡毒支原体、鸡肠炎沙门氏菌进行PCR反应，以确定建立的PCR诊断试剂盒的特异性，结果猪肺炎支原体标准株、猪肺炎支原体活疫苗168株为阳性，大肠杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜杆菌、鸡毒支原体、鸡肠炎沙门氏菌为阴性(见图3)。重复性试验 应用建立的PCR方法，重复检测猪肺炎支原体DNA样品3次，结果均一致。试剂盒的保存期检测 将试剂盒保存在4°C、一 20°C分别于I月、3月、6月、I年，对阳性样品进行检测，4°C保存I年条带较淡，一 20°C保存I月、3月、6月、I年条带亮度无影响。试剂盒对临床样品的检测 对2010年 2012年贵州省贵阳市、黔南州、铜仁地区、瓮安县几个规模化养猪场和养猪专业户采集的58份病料进行检測，同时进行细菌学和生化检验。共检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪支原体肺炎PCR诊断试剂盒,其特征在于：它包括浓度为0.1moL/L的PBS40uL，裂解液250uL，DL2000100uL，PCR酶250uL，超纯水170uL，引物40uL，阳性对照20uL及阴性对照20uL；其中引物包括上游引物及下游引物，上游引物及下游引物各20?uL，上游引物的序列为5’??TAGACCAGGATGGACAAGATGAT??3’，下游引物的序列为5’??AACCACAGGACTAAGACGCAACA??3’。

【技术特征摘要】
1.一种猪支原体肺炎PCR诊断试剂盒，其特征在于它包括浓度为O.1moL/L的PBS40uL,裂解液 250uL, DL2000100uL, PCR 酶 250uL,超纯水 170uL,引物 40uL,阳性对照20uL及阴性对照20uL;其中引物包括上游引物及下游引物，上游引物及下游引物各20 uL，上游引物的序列为5 ’ - TAGACCAGGATGGACAAGATGAT _3 ’，下游引物的序列为5 ’ -AACCACAGGACTAAGACGCAACA -3'2.根据权利要求1所述的猪支原体肺炎PCR诊断试剂盒，其特征在于阴性对照为超纯水，共计20 uL。3.根据权利要求1所述的猪支原体肺炎PCR诊断试剂盒，其特征在于阳...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨莉，余波，吴位珩，史开志，杨茂生，
申请(专利权)人：贵州省畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：