本发明专利技术公开了一种花药培养分子标记检测鉴别烟草Va基因型的方法，常用的烟草马铃薯Y病毒（Potato?virus?Y，PVY）抗源的抗性表现为隐性基因（va）控制，烤烟抗PVY育种，需要鉴定单株Va基因是否为杂合体和纯合体；目前已有Va基因型的RAPD标记O12V3695与SCAR标记PVYME1，由于缺少Va共显性的DNA标记或相斥相标记，不能直接采用分子标记筛选杂合体和纯合体；本发明专利技术采集待鉴定烟草单株的花药，利用花药培养出单倍体苗，检测单倍体苗的标记分离情况，根据标记分离情况鉴定单株的Va基因型是否为纯合体和杂合体。本发明专利技术与常规测交方法相比，具有相对省时省力的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于作物育种
，具体为烟草质量性状抗病性转育的目的基因型筛选技术。
技术介绍
烟草马铃薯Y病毒病，又称为脉斑病，是由马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)引起的蚜传病毒病，在中国北方烟区危害严重，在南方烟区的危害呈上升趋势。为选育抗病品种，国内外鉴定出多个抗PVY的种质资源，如VAM、V. SCR等，并育成抗病白肋烟品种TN86、TN90和烤烟品种NC55、NC102等。大部分抗源的抗性表现为隐性基因(va)控制，是由于对PVY感病的基因缺失造成的。并开发出与Va位点相关的分子标记 (RAPD、SCAR) (Noguchi S. ,Mol Gen Genet, 1999, 262:822-829;Julio et al. , TheorApplGenet. 2006，112(2) :335-346.)。烤烟种质RY5对PVY坏死株系(PVYn)的抗性符合孟德尔一对隐性基因控制的质量性状的遗传模型，已报道与抗病基因对应的显性等位基因位点(Va)紧密连锁的RAPD标记012V3695与SCAR标记PVYMEl (王贵等，分子植物育种,2012, 10 (I) : 97-103)。但缺乏共分离的可区分VaVa与Vava的分子标记，回交转育va位点时，不能直接利用分子标记辅助选择。通常采用测交方法筛选Vava单株，每回交一代需要测交并接种筛选一次，比较费时费力。烟草花药培养技术简便，能在2个月左右培养出单倍体苗。理论上Vava植株的花培单倍体后代，Va单株与va单株的比例为1:1。因此，采用分子标记检测花培单倍体后代，能快速鉴定出Va单株与va单株的比例，从而间接鉴定出基因型为Vava的单株。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有测交鉴定VaVa与Vava单株的方法存在之不足，提供，这是一种新的花药培养标记检测的方法，能有效提高转育烟草va位点的效率和烟草品种选育效率。本专利技术的技术原理为烟草为二倍体植物，基因型为VaVa的植株，产生Va的一种雄配子。基因型为Vava的植株，产生Va和va两种雄配子。采用花药培养方法，可获得单个雄配子发育而成的单倍体苗。通过检测来源于某个单株的一定数量的单倍体苗中Va和va基因型苗的比例，即可鉴定该单株的Va基因型是否纯合与杂合。本专利技术根据烟草花药培养技术简便成熟、烟草抗PVY的va位点对应的Va位点已有分子标记文献报道，通过组合花药培养和分子标记辅助选择技术，鉴定烟草Va基因型。花药培养标记检测与测交接种方法比较，具有节省时间、减少收种工作量、所需光照培养室的空间很小，日常管理人工少等优点。而采用测交接种方法，需要对2倍数量的单株收种，并进行育苗、盆栽、接种病原菌、调查抗性分离情况等一系列工作。由于冬春季气温低，在南方日光型温室中耗时较长(5个月左右)、育苗、盆栽和接种需要的温室面积较大，日常管理人工多。本专利技术目的通过以下技术方案予以实现—种花药培养分子标记检测鉴别烟草Va基因型的方法，其特征在于采集待鉴定烟草单株的花药，利用花药培养出单倍体苗，检测单倍体苗的标记分离情况，根据标记分离情况鉴定单株的基因型是否为纯合体和杂合体。所述的每个待鉴定烟草单株的花药培养出至少4株单倍体苗，取每株单倍体苗的叶片，提取DNA，检测与烟草PVY抗性基因Va位点紧密相关的RAPD标记012V3695与SCAR标记PVYME1，根据标记的实际分离比与理论分离比的吻合情况，分析单株的Va基因型是否为纯合体和杂合体。单株花药培养单倍体苗获得对需要鉴定基因型的单株，采集花冠与花萼等长的花蕾，每株采集10个左右。参照文献(陈学军等，植物遗传资源学报，2011，20 (I) :65-68)花药培养。随机选择10株左右花药培养单倍体苗，转移至新的生根培养基上，继续培养至 约4-5片叶。采集每株单倍体苗的叶片用于Va分子标记检测。花药培养单倍体苗分子标记检测采用市售试剂盒或者CTAB方法提取叶片总基因组DNA。采用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法检测DNA质量，质量合格的DNA样品，用O. 5XTE溶液稀释至3(T50ng/l·! L，_20°C保存备用。与PVY抗性紧密连锁的分子标记检测采用下列引物扩增获得，包括但不限于SCAR标记引物PVYMEl (Julio et al.，TheorAppl Genet. 2006，112(2) :335-346.)，目标条带 HZbpt5RAPD标记012V3695 (Noguchi S. ,MolGen Genet, 1999,262:822-829)，目标条带695bp。引物和PCR试剂购自市售公司。PCR反应在基因扩增仪上进行。PCR反应体系体积为20 μ L，其中3(T50ng/ μ L DNA样品2. 5 μ L、10 X PCRbuf fer2. O μ L, 2. 5mM dNTPs2. 5 μ L, 10 μ M 弓 I 物 1.5yL，5U/yL rTaq DNA 酶0.5μ L, ddH201L O μ L。PVYMEl 扩增的程序为94°C预变性 5min ;94°C变性 30sec，62°C退火45sec，72°C延伸lmin，共35个循环，72°C延伸5min，4°C保存。采用琼脂糖凝胶电泳检测标记的目的条带，采用凝胶成像系统记录结果。单株基因型结果分析花药培养单倍体苗扩增出Va的目标条带，判断为Va标记阳性，花药培养单倍体苗未扩增出Va的目标条带，判断为Va标记阴性。若某个单株的花药培养单倍体苗的Va标记阳性株数与阴性株数的比例符合1:0的理论分离比，则该单株的基因型为VaVa。若某个单株的花药培养单倍体苗的Va标记阳性株数与阴性株数的比例符合1:1的理论分离比，则该单株的基因型为Vava。常用的烟草马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)抗源的抗性表现为隐性基因(va)控制，烤烟抗PVY育种，需要鉴定单株Va基因是否为杂合体和纯合体；目前已有Va基因型的RAPD标记012V3695与SCAR标记PVYME1，由于缺少Va共显性的DNA标记或相斥相标记，不能直接采用分子标记筛选杂合体和纯合体；本专利技术采集待鉴定烟草单株的花药，利用花药培养出单倍体苗，检测单倍体苗的标记分离情况，根据标记分离情况鉴定单株的Va基因型是否为纯合体和杂合体。本专利技术与常规测交方法相比，具有相对省时省力的优点。附图说明图1为花药培养单倍体苗的PVYMEl标记检测成像记录。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的说明，但实施例不是对本专利技术的限定。实施例11.1植物材料转育va位点的回交I代单株由烤烟种质RY5(PVY抗病亲本)和烤烟种质Coker176(PVY感病亲本)常规杂交回交获得。1. 2花药培养 对田间株型较好的单株，采集花冠与花萼等长的花蕾，每株采集10个左右。参照文献(陈学军等，植物遗传资源学报，2011，20(1) :65-68)花药培养。每个单株随机选择10株左右花药培养单倍体苗(简称花培苗)，转移至新的生根培养基上，继续培养至约4-5片叶。采集O.1g叶片组织，用于DNA提取。1. 3分子标记检测采用试剂盒(DNeasyPlant Mini Kit, Qiagen, GmbH German本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种花药培养分子标记检测鉴别烟草Va基因型的方法，其特征在于：采集待鉴定烟草单株的花药，利用花药培养出单倍体苗，检测单倍体苗的标记分离情况，根据标记分离情况鉴定单株的基因型是否为纯合体和杂合体。
【技术特征摘要】
1.一种花药培养分子标记检测鉴别烟草Va基因型的方法，其特征在于采集待鉴定烟草单株的花药，利用花药培养出单倍体苗，检测单倍体苗的标记分离情况，根据标记分离情况鉴定单株的基因型是否为纯合体和杂合体。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于每个待鉴定烟草单株的花药培养出至少4 株单倍体苗，取每株单倍体苗的叶片，提取DNA，检测与烟草PVY抗性基因Va位点紧密相关的RAPD标记012V3695与SCAR标记PVYMEl，根据标记的实际分离比与理论分离比的吻合情况，分析单株的Va基因型是否为纯合体和杂合体。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的烟草单株花药培养单倍体苗时，对需要...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘勇，陈学军，肖炳光，卢秀萍，王贵，杨彦明，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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