基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型克螟稻1的方法技术

本发明专利技术提供了一种基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型克螟稻1的方法，其是以5′-TATCTCCTCATTGGCACACCACCTG-3′和5′-CTCGTCAGCAACTGGGGTGTTCCGC-3′为引物，进行长距离聚合酶链式扩增，以纯合外源基因KMD1基因组DNA为模板可以扩增出一条长片段(8884bp)，以杂合外源基因KMD1基因组DNA为模板扩增出两条片段(8884bp和240bp)，以非转基因水稻基因组DNA为模板能扩增出一条短片段(240bp)，从而可以快速准确地鉴定出纯合型转基因抗虫水稻KMD1，为后续的转基因作物遗传育种奠定基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及转基因植物检测领域，具体地说，涉及一种基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型克螟稻I的方法。
技术介绍
标准物质是食品、农产品中转基因成分检测的“金标准”，是开展转基因生物安全监管的基准物。开发转基因成分检测标准物质对原材料的均匀性、稳定性、特征量值范围等方面有严格要求。目前，国内外转基因成分检测普遍采用基于核酸的定性、定量检测方法。 其中定量检测通常采用RealTime-PCR方法对样品中靶标核酸序列进行绝对定量，即测定外源DNA插入特征序列的拷贝数，并以此为基础计算样品中转基因成分的含量。在转基因成分检测中，可以将外源DNA看作一个基因座位，一个纯合体的2倍体基因组中检测靶标核酸序列，即外源DNA插入特征序列的拷贝数为2，一个杂合体的2倍体基因组中外源DNA插入特征序列的拷贝数为1，非转基因材料中则为O。因而，转基因检测标准物质制备原材料的均匀性、稳定性、特征量值范围，主要体现在外源DNA插入所产生的特征序列的杂合或纯合状态。在标准物质的研制过程中，必需对原材料中靶标核酸序列的遗传特性进行确认，即确认外源DNA插入所产生的特征序列是纯合还是杂合状态。目前，已报道的转基因成分检测方法，主要包括针对外源目的基因、调控元件的筛选检测和基因特异性检测，针对遗传转化载体的特征建立特异性检测，针对外源DNA插入特征序列的品系特异性检测等三类。利用以上方法，只能确定样品中是否含有转基因成分或含有何种转基因成分，但无法直接鉴别样品中外源DNA插入的纯合或杂合状态。国内外目前还没有针对转基因抗虫水稻克螟稻I(KMDl)外源基因纯合/杂合状 态检测方法的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型克螟稻 I (KMDl)的方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术的一种检测转基因抗虫水稻KMDl的特异性引物，其包括正向引物5 ' -TATCTCCTCATTGGCACACCA CCTG-3 '和反向引物-CTCGTCAGCAACTGGGGTGTTCCGC-3;。该引物对是基于KMDl外源基因的旁侧序列而设计的引物，利用该对引物进行长距离聚合酶链式扩增(long distance PCR，LD-PCR)，以纯合 KMDl基因组DNA为模板可以扩增出一条长片段(8884bp)，以杂合KMDl基因组DNA为模板扩增出两条片段(8884bp和240bp)，以非转基因水稻基因组DNA为模板只能扩增出一条短片段(240bp)。本专利技术提供基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型KMDl的方法，包括步骤1) 提取植物基因组；2)以步骤I)的基因组为模板，利用上述特异性引物进行PCR检测。PCR 反应条件优选为94°C Imin ；98°C 10s，66°C lOmin，30 个循环；72°C IOmin0PCR反应体系优选为反应试刻体积lOOng/plDNA 模板2μ1IOxPCR 缓冲液2.5μ12.5mMdNTPs4μ1ΙΟμΜ正向引物Ιμ ΙΟμΜ反向引物Ιμ DNA聚合酶1.25U ddH20 补足至 25μ1。本专利技术进一步提供含有上述特异性引物的检测试剂盒及其在检测纯合型转基因抗虫水稻KMDl中的应用。本专利技术首次基于外源基因旁侧序列建立转基因抗虫水稻克螟稻I(KMDl)的外源基因纯合的鉴定方法，可用于转基因检测用标准物质候选物的筛选鉴定。此外，在转基因作物遗传育种过程中，需要将转基因材料与其它材料进行杂交、转育以获得适合的栽培 品种， 利用分子生物学手段快速、简便鉴定纯合体/杂合体育种材料，有利于缩短育种进程。附图说明图1为本专利技术通过LD-PCR在水稻中的扩增结果；其中，M=Ikbplus DNA ladder ；1:空白对照；2 :非转基因水稻明恢63 ；3 :外源基因纯合的KMDl ；4 :外源基因杂合的KMD1。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等的《分子克隆实验室手册》(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中所述的条件，或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件。所用试剂和材料均为市售商品，转基因抗虫水稻KMDl和非转基因水稻明恢63可市售获得。实施例利用引物，其中正向引物为LA-KMDlF :5' -TATCTCCTCATTGGCACACCACCTG-3'，反向引物为 LA-KMDlR 5/ -CTCGTCAGCAACTGGGGTGTTCCGC-3'进行 LD-PCR 扩增鉴定 KMDl 的外源基因纯合状态。1.实验材料1.1植物材料转基因抗虫水稻KMD1，非转基因水稻明恢63。1. 2酶与试剂分子生物学试剂，TakaraLA Taq, 10XLA PCR Buffer II (Mg2+Plus)，dNTP Mixture(2. 5mM)购自 Takara Biotechnology,Ikb Plus DNA Marker 购自 TransGen Biothech0其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京生工生物技术有限公司合成。1. 3实验仪器DNA处理仪器低温混合球磨仪MM400 (Retsch)；PCR 扩增仪AB Applied Biosystems veriti 96 well Thermal Cycler (AB)；核酸电泳仪DYY-11型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)；DNA电泳分析系统GeneSnap凝胶成像分析系统；其它仪器包括恒温水浴锅、电子天平、离心机、涡旋仪、纯水仪、恒温培养箱等。2.实验方法2.1水稻基因组DNA的提取水稻单粒种植,取幼嫩叶片作为DNA提取材料,依照TianGen Plant Genomic DNA Kit (购自天根生化科技(北京)有限公司，目录号DP320 ;包括缓冲液1^1、1^2、1^3、洗脱缓冲液TE及吸附柱CB3)的操作手册，进行水稻总DNA的提取。a.称取水稻新鲜叶片lOOmg，单株分别标记，剪刀剪碎装入2ml离心管中，放入液氮中预冷，用低温混合球磨仪充分破碎。加入400 μ I缓冲液LPl和6 μ I RNase A(10mg/ ml),润旋振荡lmin,室温放置lOmin。b.加入130 μ I缓冲液LP2，充分混匀，涡旋振荡lmin。12，OOOrpm离心5min，将上 清移至新的离心管中。c.加入1. 5倍体积的缓冲液LP3，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀。将所得的溶液或者絮状沉淀加入一个吸附柱CB3中，12，OOOrpm离心30s，弃废液，吸附柱CB3 放回收集管中。d.向吸附柱CB3中加入700 μ I漂洗液Pff, 12，000离心30s,弃废液，吸附柱CB3 放回收集管中。重复此步骤如下向吸附柱CB3中加入500 μ I漂洗液PW，12，000离心30s， 弃废液，吸附柱CB3放回收集管中。14，OOOrpm离心2min，弃废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。e.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50 μ I 去离子双蒸水(ΡΗ7. 0-8. 5)，室本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测转基因抗虫水稻克螟稻1的特异性引物，其特征在于，包括：正向引物：5′?TATCTCCTCATTGGCACACCACCTG?3′和反向引物：5′?CTCGTCAGCAACTGGGGTGTTCCGC?3′。

【技术特征摘要】
1.一种检测转基因抗虫水稻克螟稻I的特异性引物，其特征在于，包括正向引物5' -TATCTCCTCATTGGCACACCACCTG-3'和反向引物5' -CTCGTCAGCAACTGGGGTGTTCCGC-3'。2.一种基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型克螟稻I的方法，其特征在于，包括以下步骤1)提取植物基因组；2)以步骤I)的基因组为模板，利用权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：金芜军，宛煜嵩，张秀杰，苗朝华，于晓芹，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：