一种建立Hormesis剂量-效应拟合模型的方法技术

本发明专利技术属于环境污染检测技术领域，涉及一种建立Hormesis剂量-效应拟合模型即Bilogistic模型的方法。该方法包括以下步骤：（1）分析化合物的稳定性；（2）菌种复苏与培养；（3）毒性测试，包括急性毒性测试及慢性毒性测试；（4）应用步骤（3）得到的实验结果计算步骤（1）分析的化合物对步骤（2）复苏培养的菌株的抑制率，以抑制率为指标进行毒性表征；（5）对毒性数据进行拟合得到Bilogistic模型。本发明专利技术的模型对数据的拟合更为方便；模型中的参数初始化更为简单；模型的建立基于受体机制假说，更具生物学意义；对于刺激效应过大的情况亦能良好地拟合；可有效指导Hormesis效应在药物设计中的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于环境污染检测
，涉及一种建立Hormesis剂量-效应拟合模型即Bilogistic模型的方法。
技术介绍
在环境领域，传统毒理学研究重心在毒物的高剂量区域，其主要目的是评估毒物的毒性大小并确定对人类安全的剂量阈值。因此，传统的生态风险评价模型主要有阈值模型和线性模型两种(如图2a和2b)。Hormesis是指毒物或化合物对生物体的 剂量-效应关系表现为在高剂量时产生抑制作用，而在低剂量时产生刺激效应的特殊现象[I]，这种双向剂量-效应模型(图2c)无疑对毒理学安全性评价一直沿用的经典剂量-效应模型提出了挑战[2]，这将会从根本上改变整个危险度评价模式，因此成为危险度评价进程中的重要里程碑。已有大量研究表明，Hormesis是在不同的模式生物、测试终点以及化合物类别下都普遍存在着的一种双向剂量-效应关系。Hormesis双向剂量-效应关系代表了整个生物学领域里对剂量-效应概念的模式转变，影响了毒理学家在生物模式、观测终点、设计研究、评估危险等方面的选择，甚至影响到毒理学家对所试验的问题与假说提出的方式。该剂量-效应模式不仅对毒理学，乃至药理学、流行病学及临床评估等方面都产生了很大的影响。目前，随着分子遗传学、蛋白质化学、人类基因组和环境基因交互作用研究的不断深入，人们对毒作用(化合物的毒性作用)机制有着不断完整的认识，以机制为基础的生态风险评价将很大程度上减少其中的不确定因素。因此，以机制为基础将显示出生态风险评价的真正科学意义，也是毒理学发展的终极目的之一 [3]。现阶段，人们对于Hormesis的研究主要围绕以下几个方面(I)形成机制目前，对于Hormesis的形成机制尚无定论，较为学界普遍接受的有受体机制假说和过度补偿理论两种[4，5]，但仍有些学者对这两种机制持怀疑态度[6]。对于Hormesis形成机制有待进一步深入的研究。(2)定量化研究由于已有的Hormesis机制的不确定，导致Hormesis的定量化研究进展缓慢，到目前为止仍未形成统一的且令人信服的评价方法。过去数十年间，学者相继提出过很多种用于拟合具有Hormesis现象的剂量-效应模型，但多为经验模型从而存在诸多不足[7]对于混合物的Hormesis效应研究更是处于起步阶段。因此，Hormesis的定量化研究亟待创建一种能广为接受的拟合模型以实现a)采用简单参数即可表征兴奋效应山)该模型可表征相应的生物学意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供以及由该方 法得到的Bilogistic模型。由该方法建立的Bilogistic模型可以拟合具有Hormesis效应的毒性数据，从而为毒物的环境生态风险评价提供更为可靠、科学的理论依据。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下本专利技术中，将剂量-效应曲线拆分为刺激作用曲线和抑制作用曲线，用Logistic模型分别拟合刺激作用曲线和抑制作用曲线，建立刺激作用曲线模型和抑制作用曲线模型，在受体机制假说的基础上建立了 Hormesis剂量-效应拟合模型-Bilogistic模型。—种建立Hormesis剂量-效应拟合模型的方法,其包括以下步骤(I)分析化合物的稳定性；(2)菌种复苏与培养；(3)毒性测试，包括步骤(I)所分析的化合物对步骤(2)培养的菌株的急性毒性测试及慢性毒性测试； (4)应用步骤(3)得到的实验结果计算步骤(I)分析的化合物对步骤(2)复苏培养的菌株的抑制率，以抑制率为指标进行毒性表征；(5)基于受体机制假说对步骤(4)得到的毒性数据进行拟合，得到Bilogistic模型。所述步骤(I)中的化合物稳定性分析，具体包括以下步骤采用高效液相色谱(HPLC)对化合物进行稳定性分析，检测化合物在试验条件下24h后浓度变化；其中高效液相色谱条件的分析条件如下高效液相色谱仪(Agilent, USA),色谱柱反相柱C18,5ym,250mmX4. 5mm,柱温 25。C ;流动相乙腈=80%(20% 水，pH=7),流速1. Oml/min ;检测波长265nm。所述步骤(2)中的菌种复苏与培养，具体包括以下步骤(2a)菌种复苏菌种复苏及传代在固体斜面培养基上进行。所述的固体培养基配方胰蛋白胨O. 5g，酵母膏O. 5g，甘油O. 3g，KH2PO4O.1g,Na2HPO4O. 5g，NaC13g,蒸馏水 lOOmL，琼脂 2g ；将明亮发光杆菌的冻干粉溶解，接种到斜面上传代3次后获得稳定发光性能的菌株备用；(2b)菌种培养将传代好的菌种用接种环接种到液体培养基作为工作菌液用，在温度为20°C，摇床转速180r/min条件下培养12h液体培养基配方胰蛋白胨O. 5g，酵母膏O. 5g，甘油O. 3g，KH2PO4O.1g,Na2HPO4O. 5g, NaC13g，蒸馏水 IOOmL0所述的步骤(3)中的毒性测试，包括以下步骤(3a)菌液的平衡移取步骤(2)适量工作菌液(以光值为控制指标来添加)到20mL3%NaCl溶液中，控制光值测定范围在20万左右，20°C条件下搅拌40min ；(3b)毒性测试急性毒性测试基于Micortox的测定原理，每个小试管先加入800 μ L不同浓度测试溶液(空白为含1%DMS0的NaCl溶液)，统一震荡Imin混匀；再加入200 μ L菌液，统一震荡Imin混匀后，置于20° C室温下等候15min后测定光值；慢性毒性测试基于Micortox的测定原理,每个小试管先加入400 μ L不同浓度测试溶液(空白为含1%DMS0的NaCl溶液)，再加入400 μ L高倍液体培养基，统一震荡Imin混匀；再加入200 μ L菌液，统一震荡Imin混匀后，置于20° C恒温培养箱中180r/min恒温培养24h再取出采用发光仪测定光值。高倍液体培养基的配制由于慢性毒性测试时间比较长(24h)，测试样需加入适量培养基以保持发光菌正常生长所需营养，因此需提前配制高倍液体培养基以备慢性毒性测试中加样时使用。高倍液体培养基配方胰蛋白胨O. 5g，酵母膏O. 5g，甘油O. 3g，KH2PO4O.1g,Na2HPO4O. 5g, NaC13g,蒸懼水 40mL。所述固体培养基、液体培养基及高倍液体培养基均用lmol/L NaOH调pH至7. O。所述的步骤(4)中毒性表征是指对于步骤(3)得到的毒性测试数据，用毒物对发光菌的发光值的抑制率表征，计算如下抑制率％=100%X (对照抑制率一样品抑制率)/对照抑制率其中，对照抑制率指的是样品前后的空白平均抑制率；所述的步骤(5)中的受体机制假说，包括以下内容化合物对机体产生的作用中存在两种关键蛋白，化合物与亲和力(affinity)和容力(capacity)不同的两种蛋白结合的差异导致了刺激和抑制两种相反的效应，低浓度时化合物与具有高亲和力的蛋白起作用，对机体表现出刺激效应；高浓度时，随着化合物的分子增加，亲和力低但却具备更高容力(如，数目更多)的蛋白受体渐渐占据主导作用，从而表现出与低浓度相反的抑制作用。本专利技术根据受体机制假说，将步骤(4)毒性表征拟合得到的剂量-效应曲线h(x)拆分为两条S型曲线，分别为代表刺激作用的f(x)和抑制作用的g(x)。考虑到S型曲线在生物模型中的普遍性，尝试用Logistic模本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种建立Hormesis剂量?效应拟合模型的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）分析化合物的稳定性；（2）菌种复苏与培养；（3）毒性测试，包括步骤（1）所分析的化合物对步骤（2）培养的菌株的急性毒性测试及慢性毒性测试；（4）应用步骤（3）得到的实验结果计算步骤（1）分析的化合物对步骤（2）复苏培养的菌株的抑制率，以抑制率为指标进行毒性表征；（5）基于受体机制假说对步骤（4）得到的毒性数据进行拟合，得到Bilogistic模型。

【技术特征摘要】
1.一种建立Hormesis剂量-效应拟合模型的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)分析化合物的稳定性； (2)菌种复苏与培养； (3)毒性测试，包括步骤(I)所分析的化合物对步骤(2)培养的菌株的急性毒性测试及慢性毒性测试； (4)应用步骤(3)得到的实验结果计算步骤(I)分析的化合物对步骤(2)复苏培养的菌株的抑制率，以抑制率为指标进行毒性表征； (5)基于受体机制假说对步骤(4)得到的毒性数据进行拟合，得到Bilogistic模型。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(I)中化合物的稳定性分析，具体包括以下步骤 采用高效液相色谱对化合物进行稳定性分析，检测化合物在试验条件下24h后浓度变化；其中高效液相色谱条件的分析条件如下高效液相色谱仪的色谱柱反相柱α8，5μπι，250mmX4. 5mm,柱温 25° C ;流动相乙腈=80%,水=20%, pH=7,流速1. Oml/min ;检测波长265nm。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中的菌种复苏与培养，具体包括以下步骤 (2a)菌种复苏 菌种复苏及传代在固体斜面培养基上进行；将明亮发光杆菌的冻干粉溶解，接种到斜面上传代3次后获得稳定发光性能的菌株备用； 其中所述的固体培养基配方为胰蛋白胨O. 5g，酵母膏O. 5g，甘油O. 3g，KH2PO4O.1g,Na2HPO4O. 5g，NaC13g,蒸馏水 lOOmL，琼脂 2g ； (2b)菌种培养 将传代好的菌种用接种环接种到液体培养基作为工作菌液用，在温度为20°C，摇床转速180r/min条件下培养12h ； 其中所述的液体培养基配方胰蛋白胨O. 5g，酵母膏O. 5g，甘油O. 3g，KH2PO4O.1g,Na2HPO4O. 5g, NaC13g，蒸馏水 IOOmL ； 其中所述固体培养基、液体培养基均用lmol/L NaOH调pH至7. O。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤(3)中的毒性测试，包括以下步骤 (3a)菌液的平衡 移取步骤(2)适量工作菌液到20mL3%NaCl...

【专利技术属性】
技术研发人员：林志芬，陈瑞，邓子卿，丛永平，尹大强，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：