牛干扰素-τ原核表达及产物的纯化与生物活性鉴定方法，它涉及牛干扰素-τ技术领域。它的克隆和重组载体构建为：通过生物信息学分析，设计的引物，通过PCR扩增获得牛IFN-τ成熟蛋白的CDS，以pMD18-T为克隆载体，在E.coli?JM109菌株中进行其CDS的分子克隆，并测序；以pET28a+作为表达载体，在E.coli?BL21(DE3)工程菌株中进行带组氨酸标签的bIFN-τ蛋白的融合表达。它采用大肠杆菌工程菌株作为表达体系，可实现大规模发酵培养；但对bIFN-τ基因进行改造，在表达产物中加入His6-Tag，实现了表达产物的快速高纯度纯化。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及牛干扰素-τ
，具体涉及一种。
技术介绍
牛干扰素τ (bIFN- τ )是由早期胚胎滋养层细胞产生，它能够阻止子宫内膜上溶黄体分子机制的发生，促进黄体的发育，从而启动妊娠过程。大量的研究表明，bIFN-τ除了对妊娠识别过程起决定性的作用外，还在调节妊娠识别向胚胎植入转变过程中，发挥重要作用。 现有技术中一、原核表达体系1990年Klemann在大肠杆菌中表达的bIFN-τ的(Spencer TE，2004)，Li (Spencer TE, 2004)和 Ealy(Bazer FW，1996)在大肠杆菌中表达的bIFN-τ ;国内吕丽艳(2006)在大肠杆菌中表达的人干扰素τ。二、真核表达体系Roberts和Ott (1991)用酵母表达的oIFN τ , 1993年Johnson在毕赤酵母中表达的 bIFN- τ (Ryan AM, et al, 1993) ；Nagaya(2004)在家蚕体内表达的 bIFN- τ ；Takahashi (2003)在ΤΝ-5昆虫细胞系中表达的bIFN- τ。三、纯化方法主要用葡聚糖分子筛层析结合离子交换层析，纯度在91%左右，获得的bIFN-τ抗病毒活性达到108IU/mg。其上所述的方法存在以下缺点一、纯化过程复杂分子筛层析结合离子交换层析纯化条件探索复杂，而且纯化后纯度不高；二、难以实现大规模发酵生产早期的大肠杆菌员和表达体系采用的大肠杆菌不属于工程菌；酵母真核表达和昆虫细胞表达体系复杂，难以实现大规模培养和表达；三、抗病毒生物活性鉴定方法复杂牛干扰素-τ的抗病毒活性本身较低，采用病毒活性检测方法复杂，检测的可靠性不高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种，它采用大肠杆菌工程菌株作为表达体系，可实现大规模发酵培养；但对bIFN-τ基因进行改造，在表达产物中加入His6-Tag,实现了表达产物的快速高纯度纯化；在活性鉴定上，模拟bIFN- τ在体作用的靶细胞-子宫内膜细胞，对其进行活性分析，避免了复杂的抗病毒活性分析方法。为了解决
技术介绍
所存在的问题，本专利技术是采用如下技术方案它的克隆和重组载体构建为通过生物信息学分析，获取牛IFN- τ成熟蛋白的CDS序列，以pMD18_T为载体，在E. coli JM109菌株中进行IFN-τ成熟蛋白⑶S区的分子克隆，并测其序列；以pET28a+作为表达载体，在E. coli BL21工程菌株中进行bIFN- τ组氨酸标签蛋白的融合表达；运用蛋白质组学分析工具，对表达产物的基本性质、糖基化位点、磷酸化位点、激酶作用位点、疏水性、二硫键位置、二级结构、三级结构和保守结构域进行预测，初步分析了bIFN-τ表达产物与bIFN-τ成熟蛋白的差异；采用蛋白质亲和层析技术，对bIFN-τ表达产物进行纯化，采用等电聚焦和肽指纹技术对纯度进行鉴定，建立了一套完整的bIFN- τ表达产物纯化方法；最后以牛子宫内膜细胞作为研究模型，模拟在体水平的激素浓度，研究了 bIFN- τ对牛子宫内膜上妊娠识别相关基因表达的影响来进行生物活性鉴定。所述的采用特异引物进行PCR扩增获得了 bIFN-τ成熟蛋白的CDS，并构建了bIFN- τ成熟蛋白的⑶S的克隆载体，其步骤为(I)、采用通用的酚-氯仿法从牛全血中提取基因组DNA ；(2)、采用特异的引物对牛bIFN-τ成熟蛋白CDS进行扩增，并在扩增同时在引物上设计Nde I和BamH I酶切位点。引物为Forward :5’ -CAT ATG TGT TAC CTG TCT GAG GAC CAC-3’ Reverse :5’ -GGA TCC TTA TCA AAG TGA GTT CAG ATC TCC-3’PCR 扩增体系为2XTaq PCR MasterMi s 25. O μ L，上下游引物各 2 μ L，DNA 模版2 μ L，加水至50 μ Lo扩增条件为95°C预变性2min, 94°C变性Imin，58°C退火Imin，72。。延伸Imin, 35个循环,最后延伸lOmin。(3)克隆载体构建和测序PCR产物为534bp，通过离心柱型DNA回收试剂盒对PCR产物进行回收和纯化，将PCR产物与克隆载体PMD18-T载体链接后转化到感受态大肠杆菌细胞，然后用Amp/LB/X-gal/IPTG琼脂糖平板筛选阳性克隆。白色的阳性菌落再次在LB中培养后，通过酶切、PCR扩增和测序方法对阳性克隆载体进行鉴定，获得pMD18-bIFN_ τ克隆质粒。所述的bIFN- τ表达载体构建和诱导条件为(I)用质粒提取试剂从阳性Ε. coli JM109菌中提取克隆质粒pMD18_bIFN_ τ，然后分别用Nde I和BamH I对pMD18_bIFN_ τ、PET_28a(+)进行双酶切，琼脂糖电泳后回收目的产物。然后利用T4DNA连接酶在16°C下20h，进行目的基因与表达载体间的连接。最后将连接产物转入感受态的E. coli BL21 (DE3)，用Kan/LB琼脂糖平板筛选白色重组体菌落，将白色菌斑采用PCR扩增、酶切和测序进行阳性鉴定。(2)、将鉴定的阳性重组菌接种于3ml Kan/LB液体培养基中，37°C，250r/min摇菌培养过夜；吸取菌液按1: 100的比例接种于50mlKan/LB液体培养基中，37°C，250r/min摇菌培养至OD600 = O. 6 1. O ;加入IPTG，使终浓度为1. OmmoI/L,于37°C，250r/min振摇诱导培养4h，可获得最大表达量的重组蛋白。所述的bIFN-τ表达产物的纯化和生物活性鉴定为(l)blFN- τ的纯化诱导表达的大肠杆菌经洗涤、超声波破碎、离心获得包涵体；包涵体用8Μ脲变性缓冲液溶解后，用HisTrap HP亲和层析柱纯化表达产物。用400mM的咪唑洗，在该条件下bIFN-τ表达产物的得率最高，占上柱总蛋白的26.36%。柱上复性用1.5M脲的洗脱缓冲液能够获得bIFN- τ表达产物。洗脱产物用HisTrapDesalting脱盐后，bIFN- τ表达产物溶液的电导性从50mS/cm降低到4mS/cm。(2)生物活性鉴定将纯化的bIFN- τ表达产物，以中浓度100ng/mL的浓度添加到无血清培养的牛子宫内膜细胞中，培养24h后，与未添加bIFN- τ的对照组相比，如果添WbIFN-T的子宫内膜细胞上0XTR、ER-a和ER-β的表达水平显著降低，表明bIFN-τ抑制了 0XTR、ER-a和ER-β的表达，这与bIFN-τ在体的生物学功能一致，反映重组表达获得的bIFN-τ具有生物活性。本专利技术采用大肠杆菌工程菌株作为表达体系，可实现大规模发酵培养；但对bIFN- τ基因进行改造，在表达产物中加入His6_Tag，实现了表达产物的快速高纯度纯化。附图说明图1为本专利技术中克隆载体与重组载体构建示意图，图2为本专利技术中基因和内参基因引物序列表。具体实施例方式参看图1-图2，本具体实施方式采用如下技术方案它的克隆和重组载体构建为通过生物信息学分析，获取牛IFN- τ成熟蛋白的⑶S序列，以pMD18-T为载体，在E. coliJM109菌株中进行IFN- τ成熟蛋白⑶S区的分子克隆，并测其序列；以pET28a+作为表达载本文档来自技高网...
【技术保护点】
牛干扰素?τ原核表达及产物的纯化与生物活性鉴定方法，其特征在于它的克隆和重组载体构建为：通过生物信息学分析，设计的引物，通过PCR扩增获得牛IFN?τ成熟蛋白的CDS，以pMD18?T为克隆载体，在E.coli?JM109菌株中进行其CDS的分子克隆，并测序；以pET28a+作为表达载体，在E.coli?BL21(DE3)工程菌株中进行带组氨酸标签的bIFN?τ蛋白的融合表达；运用蛋白质组学分析工具，对表达产物的基本性质、糖基化位点、磷酸化位点、激酶作用位点、疏水性、二硫键位置、二级结构、三级结构和保守结构域进行预测，初步分析了bIFN?τ表达产物与bIFN?τ成熟蛋白的差异；采用固相金属离子亲和层析技术，对bIFN?τ表达产物进行纯化，建立了一套完整的bIFN?τ表达产物纯化方法；最后以牛子宫内膜细胞作为研究模型，模拟在体水平的激素浓度，研究了bIFN?τ作用下，对牛子宫内膜上妊娠识别相关基因表达的影响。
【技术特征摘要】
1.牛干扰素-τ原核表达及产物的纯化与生物活性鉴定方法，其特征在于它的克隆和重组载体构建为通过生物信息学分析，设计的引物，通过PCR扩增获得牛IFN-τ成熟蛋白的⑶S，以pMD18-T为克隆载体，在Ε. coli JM109菌株中进行其⑶S的分子克隆，并测序；以pET28a+作为表达载体，在Ε. coli BL21(DE3)工程菌株中进行带组氨酸标签的bIFN-τ蛋白的融合表达；运用蛋白质组学分析工具，对表达产物的基本性质、糖基化位点、磷酸化位点、激酶作用位点、疏水性、二硫键位置、二级结构、三级结构和保守结构域进行预测，初步分析了 bIFN-τ表达产物与bIFN-τ成熟蛋白的差异；采用固相金属离子亲和层析技术，对bIFN-τ表达产物进行纯化，建立了一套完整的bIFN-τ表达产物纯化方法；最后以牛子宫内膜细胞作为研究模型，模拟在体水平的激素浓度，研究了 bIFN-τ作用下，对牛子宫内膜上妊娠识别相关基因表达的影响。2.根据权利要求1所述的牛干扰素-τ原核表达及产物的纯化与生物活性鉴定方法，其特征在于所述的采用特异引物进行PCR扩增获得了 bIFN-τ成熟蛋白的CDS，并构建了bIFN- τ成熟蛋白的⑶S的克隆载体，其步骤为 (1)、采用通用的酚-氯仿法从牛全血中提取基因组DNA； (2)、采用特异的引物对牛bIFN-τ成熟蛋白CDS进行扩增，并在扩增同时在引物上设计Nde I和BamH I酶切位点，引物为Forward :5’ -CAT ATG TGT TAC CTG TCT GAG GAC CAC-3’Reverse :5’ -GGA TCC TTA TCA AAG TGA GTT CAG ATC TCC-3’ PCR扩增体系为2XTaq PCR MasterMis 25. O μ L，上下游引物各2 μ L，DNA模版2 μ L，加水至50yL ;扩增条件为:95°C预变性2min，94°C变性lmin，58°C退火lmin，72°C延伸Imin, 35个循环,最后延伸IOmin ； (3)、克隆载体构建和测序PCR产物为534bp，通过离心柱型DNA回收试剂盒对PCR产物进行回收和纯化，将PCR产物与克隆载体PMD18-T载体链接后转化到感受态大肠杆菌细胞，然后用Amp/LB/X-gal/IPTG琼脂糖平板筛选阳性克隆。白色的阳性菌落再次在LB中培养后，通...
【专利技术属性】
技术研发人员：张明，赖松家，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：
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