一种目的蛋白制备方法及其用途技术

本发明专利技术涉及一种目的蛋白制备方法及其用途。其制备方法为，目的蛋白的核苷酸序列片段的获得；目的蛋白重组表达载体的构建；目的蛋白的诱导表达、纯化；切割；所述目的蛋白的核苷酸序列片段的下游引入单一切割位点；所述目的蛋白通过合成编码链和模板链，将两者杂交获得，在合成编码链和模板链时引入单体切割的识别位点；优选地，其中的目的蛋白可以是人神经生长因子，胸腺肽、虎纹克胰肽、虎纹镇痛肽。采用本发明专利技术的制备方法制备得到的目的蛋白表达量高、易于纯化，基因表达产物即为目的蛋白单体，不带额外氨基酸残基，既保证了目的蛋白产物良好的生物学活性，也省去了多拷贝的切割成本，纯化简单，易于大量生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程技木，特别涉及ー种目的蛋白制备方法及其用途。
技术介绍
随着基因工程技术的发展，ー些具有生物活性的小分子多肽如胸腺肽等受到高度重视。胸腺肽是由胸腺产生的ー种蛋白质和多肽激素。早在20世纪60年代，Miller等人(Lancet, 1961，2:748 一 749.)就发现胸腺肽对免疫系统有重要作用，并从中分离到ー组分子量为1000 — 15000D的多肽混合物，称为胸腺肽组分5 (thymosin fraction 5，TF5)；随后 Goldstein 等人(Proc. Natl. Acad. Sc1. USA , 1966, 56: 1010 - 1017)从牛胸腺抽提物的TF5分离出ー种酸性多肽a I组分(thymosin a 1，T a 1)，T a I是TF5的主要活性组分，在哺乳动物中异常保守，广泛分布于哺乳动物的胸腺、脾、肺、肾、脑、血液和其他组织中，在胸腺中浓度最高。 目前，活性多肽的制备多数采用化学合成或生物组织提取的方法，作为活性多肽的胸腺肽也不例外。临床上广泛应用的用各种改良方法制备的胸腺肽类制剂大多是从动物组织中提取的多种肽类的混合物，不同公司生产的胸腺肽类制剂的活性相差甚远，而有的因生产エ艺或质量问题使产品中含有牛或猪等蛋白，注射时可产生过敏反应。因此，有人采用人胚胎胸腺作为原料，制备出人胸腺肽a I组分(thymosin a 1，T a 1)，疗效不错。但由于人胚胎来源困难，价格昂贵，而且Ta I含量很少。随着人类基因组计划的不断实施，胸腺肽的氨基酸序列顺序可以轻易获得，使化学合成类似胸腺肽的活性多肽成为可能。国内外多个研究组，比如Wang S S等、黄臻辉、苷一如等、程虎等(Int J Pept Res, 1992,40(3 -4) :344 ;药物生物技术，2001，8(4) :207 ;化工学报，2004，55 (2) : 305 ;南京エ业大学学报(自然科学版)，2004, 26(2):78)采用不同的固相方法以及适宜的技术进行了 Ta I的合成和エ艺优化，但是化学合成エ艺始終解决不了成本高、产量低、纯度差与活性低的难题。为了获得质量高、疗效好的胸腺肽类制剂，科学家开始探索应用基因工程方法制备胸腺肽，并引起了针对Ta I的广泛研究[1，2，7]。与化学合成方法或组织提取方法相比，基因工程方法用于生产Ta I制品在降低成本、提高产量、減少毒性副产物或恢复生物活性方面具有一定的优势和改良，但是，由于融合表达使目的肽在融合蛋白中所占比例小，造成宿主表达潜能浪费，而减小标签蛋白长度又降低融合蛋白稳定性。因此，无论是单独表达或是与标签蛋白形成融合改善细胞毒性作用的表达方式，都不能从根本上解决产量问题，难以作为大規模生产的エ艺技术进ー步推广。上述单拷贝或融合表达所存在的问题，可将多肽基因进行串联表达而得以解决(I)串联增加了多肽基因数量，有利于提高表达量；(2)串联多聚体形式的表达可有效屏蔽宿主毒性；(3)多聚体表达产物更稳定。因此，对Ta I多肽采用构建多聚体的方法对于提高表达量具有突出的优势。迄今，多种肽的多聚体、多拷贝形式已获得成功表达[8_11]。国内仅有少数的两篇报道中提及Ta I的定向多拷贝克隆制备方案，其一采用基因片段随机退火和PCR技术相结合的方法构建了 3个拷贝的Ta I串联构建体[28];其二采用表达盒串联法构建了含有I 一 8 个拷贝Ta I完整表达盒的构建体[29]。在第一种方法中，传统的PCR方法虽然简便易行，但是作者未考虑到串联构建体表达之后的单体切割问题，仅单纯从技术方法探讨了该方法的可行性。第二种方法虽然可以获得比较高拷贝的串联构建体，各表达盒独立表达多肽产物而规避了后续的多肽切割步骤，但是Ta I单体表达产物分子量太小，容易被降解而难以实现表达量的提升。因此，目前需要一种构建高效表达胸腺肽制品的基因工程方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种高效表达目的蛋白的基因工程方法。为实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案，包括以下步骤目的蛋白的核苷酸序列片段的获得；目的蛋白重组表达载体的构建；目的蛋白的诱导表达；目的蛋白的纯化；纯化产物的切割；所述目的蛋白的核苷酸序列片段的下游引入单一切割位点；所述目的蛋白通过合成编码链和模板链，将两者杂交获得，在合成编码链和模板链时引入单体切割的识别位点；优选地，所述目的蛋白是人神经生长因子，胸腺肽、虎纹克胰肽、虎纹镇痛肽。在切割步骤后还可以包括进一步纯化的步骤，优选是为采取HPLC纯化。还可以包括目的蛋白活性测定。所述目的蛋白基因是一或多个拷贝；优选地，所述目的蛋白基因的多拷贝数通过将目的蛋白基因片段进行体外串联连接来实现。所述的单一切割位点是根据密码子规则编码的氨基酸序列；优选地，所述氨基酸序列为R或W或M或D或E或K。所述的英文大写字母为氨基酸的代码，比如R表示精氨酸，W表示色氨酸，M表示甲硫氨酸，D表示天冬氨酸，E表示谷氨酸，K表示赖氨酸,遵守20 种氨基酸的密码子表。所述目的蛋白基因的核苷酸序列片段的获得为，合成目的蛋白基因模板链和编码链；经过变性退火处理将编码链和模板链杂交获得杂交双链，杂交双链在反应体系中具有逐一定向连接形成多聚体的特征，所述多聚体含有2个及以上拷贝数目的蛋白基因片段；优选的，还可以包括将形成的多聚体作为聚合酶链式反应的模板进行更多目的蛋白基因拷贝数的获得。所述的表达载体为原核表达系统，优选为pET系统、pGEX系统、pMAL系统；所述的目的蛋白的纯化为采用亲和层析柱进行纯化，优选为，亲和层析柱的标签为His标签、GST标签、MBP标签。 所述纯化产物的切割可以是化学试剂或酶切割，优选地是BrCN切割。具体步骤可以是在纯化后的蛋白质中加BrCN溶液后置4°C冰箱处理24小时，加等体积双蒸H2O冷冻干燥。本专利技术还保护由该方法所得的目的蛋白制品。本专利技术还保护由该方法所得的目的蛋白制品用于医药的用途。本专利技术以胸腺肽为例来说明本专利技术的方法。 本专利技术提供的方法具有如下设计方案1、根据基因组数据库获得编码目的蛋白的基因编码区碱基序列，并商业化合成模板链和编码链寡核苷酸链；2、合成的寡核苷酸链具有如下特征编码链和模板链的3’端下游序列的下游均引入单一切割位点序列，所述单一切割位点序列具有如下特征根据密码子规则编码的氨基酸序列可被化学试剂或酶单一切割。优选的，所述单一切割位点序列编码单个氨基酸，即R或 W或M或D或E或K ;3、所述单一切割位点序列被化学试剂和酶切割后，目的蛋白羧基端末端以及下游均产生一个多余的氨基酸，确切地，该氨基酸为R或W或M或D或E或K;4、所述编码链和模板链经过变性退火处理后获得杂交双链，所述杂交双链具有如下特征双链5’端均有3个碱基的粘性末端，且粘性末端具有碱基互补性，并且互补性又具有定向性；5、所述定向性是指线性DNA双链互补粘性末端发生且仅5’端粘性末端和3’端粘性末端的互补配对；6、所述杂交双链在反应体系中具有逐一定向连接形成多聚体的特征，所述多聚体含有 2个及以上拷贝数目的蛋白基因片段。所述多聚体形成的混合物可以作为聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction, PCR)的模板；7、所述模板可被根据感兴趣本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种目的蛋白的制备方法，其特征是：包括如下步骤，目的蛋白的核苷酸序列片段的获得；目的蛋白重组表达载体的构建；目的蛋白的诱导表达；目的蛋白的纯化；纯化产物的切割；所述目的蛋白的核苷酸序列片段的下游引入单一切割位点；所述目的蛋白通过合成编码链和模板链，将两者杂交获得，在合成编码链和模板链时引入单体切割的识别位点；优选地，所述目的蛋白是人神经生长因子，胸腺肽、虎纹克胰肽、虎纹镇痛肽。

【技术特征摘要】
1.一种目的蛋白的制备方法，其特征是包括如下步骤，目的蛋白的核苷酸序列片段的获得；目的蛋白重组表达载体的构建；目的蛋白的诱导表达；目的蛋白的纯化；纯化产物的切割；所述目的蛋白的核苷酸序列片段的下游引入单一切割位点；所述目的蛋白通过合成编码链和模板链，将两者杂交获得，在合成编码链和模板链时引入单体切割的识别位点；优选地，所述目的蛋白是人神经生长因子，胸腺肽、虎纹克胰肽、虎纹镇痛肽。2.权利要求1的构建方法，其特征在于，在切割步骤后还包括进一步纯化的步骤；任选地，还包括目的蛋白活性测定。3.权利要求1或2的构建方法，其特征在于，所述目的蛋白基因是I或I个以上拷贝； 优选地，所述目的蛋白基因的I个以上拷贝数通过将目的蛋白基因片段进行体外串联连接来实现。4.权利要求1或2的构建方法，其特征在于，所述的单一切割位点是根据密码子规则编码的氨基酸序列；优选地，所述氨基酸序列为R或W或M或D或E或K。5.权利要求1或2的构建方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：任宏伟，凡复，陈星，陈胜亮，
申请(专利权)人：厦门北大之路生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：