脑炎病毒蛋白及其编码基因与一种应用制造技术

本发明专利技术公开了一种与脑炎病毒疫苗相关蛋白及其编码基因与应用。本发明专利技术提供的蛋白是如下1）或2）的蛋白：1）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白；2）将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1）衍生的蛋白。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术获得的重组腺病毒vAd-QE有希望成为脑炎基因工程疫苗的候选疫苗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种脑炎病毒蛋白及其编码基因与应用。
技术介绍
脑炎是由病毒直接侵犯或由病毒或其他异种蛋白引发的超敏反应所致的大脑急性炎症性疾病。脑炎可以是病毒性感染原发的临床表现，或者是继发的临床表现，引起原发的脑炎的病毒有脊髓灰质炎病毒，埃可病毒、柯萨奇病毒等流行性病毒，或散发性的通过蚊子、蝶等节肢动物传播的黄病毒属的森林脑炎和批膜病毒科甲病毒属的东方马脑炎病毒 坐寸o甲病毒为披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒属(Alphavirus)成员，以蚊蝶等吸血昆虫为传播媒介，可引起多种人畜共患传染病。近年来，国外已对多株甲病毒部分或全部序列测序。国内对这类病毒的分子生物学研究亦取得一定的结果。已有的研究结果表明该病毒属中和抗体决定簇主要集中在结构蛋白El和E2等糖蛋白上，其中E2蛋白上所占比例更高。加之近年来腺病毒载体因具有安全性好、宿主范围广、感染效率高等多种优点，被广泛用于基因治疗和基因工程疫苗研究，为此我们分析比较了多株甲病毒核苷酸序列，人工合成了同源性较高的3kb的核苷酸，利用腺病毒载体构建重组基因工程疫苗，为预防和治疗疾病奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种与脑炎病毒疫苗相关蛋白及其编码基因。本专利技术提供的蛋白QE，人工合成，是如下I)或2)的蛋白I)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白；2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由I)衍生的蛋白质。序列表中的序列2由982个氨基酸残基组成，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述蛋白质QE的编码基因也是本专利技术保护的范围，所述编码基因为如下1)-4)中任一所示的基因I)序列表中序列I所示的DNA分子；2)序列表中序列I自5’末端第1-2946位核苷酸所示的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA分子杂交且具有相同功能的DNA分子；4)与I)或2)限定的DNA序列至少具有90%同源性且具有相同功能的DNA分子。含有上述编码基因的重组载体、转基因细胞系、重组菌、表达盒或重组病毒也是本专利技术保护的范围。所述重组载体为pAdeasy-1和重组穿梭质粒经过同源重组得到的；所述重组穿梭质粒是在载体PShuttle-CMV的KpnI和HindIII酶切位点间插入所述编码基因得到的。所述重组病毒为重组腺病毒；所述重组腺病毒为将上述蛋白的编码基因转染宿主细胞获得的重组腺病毒。所述宿主细胞为真核细胞，优选为离体的哺乳动物细胞，尤其优选为HEK-293细胞。本专利技术的另一个目的是提供一种疫苗。 本专利技术提供的疫苗，其活性成分为如下任意一种I)所述的蛋白；2)所述编码基因；3)所述重组腺病毒。上述重组腺病毒在制备疫苗中的应用也是本专利技术保护的范围。所述疫苗为脑炎病毒疫苗。上述重组腺病毒在制备提高IFN-Y活性的增强剂中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术的实验证明，从脑炎病毒克隆出QE通过转染HEK-293细胞而组装成携带有目标抗原基因的重组腺病毒vAd-QE。重组腺病毒vAd-QE感染293细胞能有效表达目的蛋白；通过滴鼻途径接种BalB/C小鼠，利用间接免疫荧光技术检测特异性抗体水平，结果表明，所构建的重组腺病毒虽然产生特异性抗体的时间和维持的水平有所不同，但均产生了较好体液免疫反应，为进一步开展免疫保护实验提供了重要的数据支持。由于病毒在机体内极微量的蛋白表达即可激起免疫反应，因此构建的携带有脑炎病毒结构基因的重组腺病毒vAd-QE，有希望成为脑炎基因工程疫苗的候选疫苗株。附图说明图1为pAdtrack-QE酶切鉴定2为重组质粒Pac I酶切和PCR鉴定具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。东部马脑炎病毒(EasternEquine Encepha lomyelitis virus)(HE Jing;CHANGGuoHui;WU Jin Song;LI ZhongDuo;ZHU QingYu Cloning and expression of E2gene ofeastern equine encephalomyelitis virus.Bulletin of The Academy of Mili taryMedical Sciences. 2002. 02.公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。)HEK-293细胞(Invitrogen公司产品，Cat. No. R750-07);实验所需限制性内切酶分别购自TaKaRa和Biolabs公司；脂质体Lipofectamin2000购自Invitrogen公司；Platinum pfx Taqase 购自 Invitrogen 公司。实施例1、重组腺病毒(vAd-QE)的获得1、含有目的基因pAdtrack-QE的构建及鉴定根据东部马脑炎病毒(EasternEquine Encephalomyelitis virus) (NC-001547)的基因组序列，突变序列中的多个位点，设计出序列表中的序列I，人工合成出序列I。设计引物扩增编码QE蛋白的基因，引物序列(引物分别含有KpnI和Hindi II酶切位点)见下QE-F: 5，ACGGggtaccATGGCATCACTAGTGACCACCATGTGT-3，QE-R: 5，ACCCaagcttTGCCAATTGCTGCTGTATTC-3，以人工合成出序列I的DNA为模板，利用QE-F和QE-R引物对进行PCR反应，得到的PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到了预期大小一致的片段，约为3Kb。经测序，该PCR产物具有序列表中的序列I自5’末端第1-2967位核苷酸，将该PCR产物的基因命名QE，其OFR为序列I的自5’末端第1-2946位核苷酸，该基因编码的蛋 白命名为QE，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2，序列2由982个氨基酸残基组成。回收PCR产物，对PCR产物进行加“A”处理，处理后的PCR样品与pMD_18T载体(TaKaRa公司产品，Code:D101A. Lot CK3201A)相连，转化DH5a感受态细胞，挑取阳性菌落提取质粒后测序验证，结果为该质粒为将序列表中序列I的自5’末端第1-2967位核苷酸插入pMD-18T得到的，命名为pTQE。用KpnI 和 HindIII 双酶切重组质粒 pTQE 和质粒 pShuttle-CMV (Invitrogen公司产品，Catalog#240007),酶切产物分别用凝胶回收试剂盒切胶回收，并在T4DNA连接酶作用下于16°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DHlOB (Invitrogen公司产品，Cat.No. 18290-015)后挑选阳性克隆，提取质粒进行测序，结果为该质粒为将序列表中序列I的自5’末端第1-2967位核苷酸插入pShuttle-CMV的KpnI和HindIII酶切位点间得到的载体，命名为 pAdtrack-QE。将pAdtrack-QE进行酶切验证，酶切产物经过1%DNA凝胶电泳。结果见图1 所示，其中 1、D本文档来自技高网...

【技术保护点】
含有蛋白的编码基因的重组载体、转基因细胞系、重组菌或表达盒；所述蛋白，是如下1）或2）的蛋白：1）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白；2）将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1）衍生的蛋白。

【技术特征摘要】
1.含有蛋白的编码基因的重组载体、转基因细胞系、重组菌或表达盒； 所述蛋白，是如下I)或2)的蛋白 1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白； 2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由I)衍生的蛋白。2.根据权利要求1所述的重组载体、转基因细胞系、重组菌或表达盒，其特征在于所述编码基因为如下al) _a4)中任一所示的基因 al)序列表中序列I所不的DNA分子； a2)序列表中序列I自5’末端第1-2946位核苷酸所不的DNA分子； a3)在严格条件下与al)或a2)限定的DNA分子杂交且具有相同功能的DNA分子； a4)与al)或a2)限定的DNA序列至少具有90%同源性且具有相同功能的DNA分子。3.根据权利要求1或2所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为pAdeasy-1和重...

【专利技术属性】
技术研发人员：常国辉，林磊，吴晓燕，户义，张雨，柳洪涛，李靖，罗彦军，孙伟，康晓平，杨银辉，祝庆余，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：