本发明专利技术涉及一种口蹄疫灭活疫苗安全种毒载体及应用，即在该载体基础上构建不同血清型的口蹄疫灭活疫苗安全生产种毒。本发明专利技术中构建的嵌合病毒既保留了经典疫苗毒株细胞适应性良好的优点，又能通过插入流行毒株的结构蛋白克服抗原匹配性不高的缺点，可快速拯救病毒进行口蹄疫灭活疫苗的生产；以本载体构建的A型或Asia?Ⅰ型或O型不同毒株嵌合病毒为弱毒，均具有良好的生物安全性，因病毒中缺失了L蛋白，在自然条件下不发生毒力返强，并且病毒对乳鼠、猪或牛的致病力大大降低或者无致病性。安全性高，不会引起口蹄疫疫情的发生，非常具有实用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及ー种ロ蹄疫灭活疫苗安全种毒载体及应用，即在该载体基础上构建不同血清型的ロ蹄疫灭活疫苗安全生产种毒。属于兽用生物制品领域。
技术介绍
ロ蹄疫是由ロ蹄疫病毒引起偶蹄动物的ー种急性、热性、高度传染性病毒性疾病。该病除ー些岛国外，曾广泛流行世界各地，给世界畜牧业造成了巨大的经济损失，为控制和扑灭ロ蹄疫世界各国投入巨资，截止2007年5月，OIE公布59个国家为非免疫的无ロ蹄疫国家，9个国家部分地区为非免疫的无ロ蹄疫地区，7个国家或地区为免疫无ロ蹄疫国家。ロ蹄疫目前仍然在亚洲、非洲、南美部分国家和地区流行。无ロ蹄疫国家为了防止ロ蹄疫的传入和再次爆发，特别是发达国家制定了一系列近乎残酷的国际贸易条例，限制ロ蹄疫流 行国家动物及其产品世界贸易。OIE也将该病列为头号动物疫病，所以ロ蹄疫素有“政治经济病”之称(谢庆阁主编，ロ蹄疫，中国农业出版社，2004 )。ロ蹄疫预防控制策略主要包括两大类其一是以扑杀为主的综合防控措施，是无ロ蹄疫的发达国家主要采取的措施，其ニ是以免疫为主的综合防控措施，是ロ蹄疫流行国家和经济不发达无ロ蹄疫国家所采取的主要措施，也是欧洲大多数国家60年代和南美部分国家80年代成功的控制和扑灭ロ蹄疫的主要措施，疫苗在其中发挥了至关重要的作用。针对我国及其周边国家和地区ロ蹄疫流行状况，我国采取以免疫为主，实施全国大面积普遍免疫结合局部扑杀和其它综合防控措施控制ロ蹄疫。实施免疫为主的综合防控措施的关键环节之ー是疫苗。易感动物在感染ロ蹄疫病毒或免疫ロ蹄疫病毒抗原以后,可以诱导机体产生抗ロ蹄疫病毒抗体，该抗体可以抵抗同型病毒的再次感染，所以人们自1925年开始就研究出ロ蹄疫病毒灭活疫苗用于ロ蹄疫的预防控制。为了提高疫苗的免疫效カ和安全性对ロ蹄疫疫苗进行了不断的探索和改进。对传统灭活疫苗改进了灭活剂，由传统的甲醛灭活改为更安全的BEI，为了提高免疫效カ将氢氧化铝水剂佐剂改为更为有效的免疫持续期更长的矿物油佐剂。探索了弱毒疫苗的可行性，先后研制了非易感动物传代、化学试剂或温度诱变等方法致弱疫苗毒株，60年代在临床上试用，发现很难找到毒力与免疫原性的平衡点，加上ロ蹄疫病毒宿主范围广，致弱毒株在不同宿主之间毒カ差异比较大，逐渐停用或禁用。90年代人们采用基因工程方法，改变结构蛋白及病毒受体结合位点“RGD”或删除致病基因“L蛋白”编码基因，构建新型基因工程致弱毒株，实验研究表明这些毒株可以作为弱毒疫苗毒株免疫动物，而且安全性能比传统致弱毒株高，但考虑到使用弱毒疫苗毒株不利于感染与免疫鉴别诊断而未广泛使用。ロ蹄疫基因工程疫苗，包括原核、真核表达系统，植物表达系统表达抗原，DNA疫苗,各种载体系统(腺病毒、痘苗病毒、伪狂犬病毒等)构建的载体疫苗,合成肽疫苗等一度给ロ蹄疫安全高效疫苗的研究带来了希望，但至今除猪用合成肽疫苗据报道有效果以外，没有一种通过国家或地区审评批准上市的ロ蹄疫新型疫苗。ロ蹄疫预防控制仍然采用传统灭活疫苗，是经过历史考验的最为有效的ロ蹄疫疫苗，但作为传统疫苗不可否认具有自身的缺陷。ロ蹄疫灭活疫苗的生产和检验必须使用强毒株病毒，疫苗生产首先采用强毒株在BHK21细胞中大量繁殖，经过灭活、纯化，配以适当的佐剂乳化而成。成品疫苗还必须使用免疫本动物强毒株攻毒进行检验。世界上严格规定ロ蹄疫疫苗制造、ロ蹄疫病毒研究必须在生物安全3级以上实验室进行，实验室或疫苗生产车间必须有高度安全的防泄漏系统，必须有高效空气过滤系统，疫苗制备抗原必须彻底灭活ロ蹄疫病毒，防止病毒泄漏扩散造成疫病暴发，所以灭活疫苗的安全性一直是人们关注的焦点。甲醛是ロ蹄疫灭活疫苗最初采用的灭活剂，但由于甲醛灭活凝固蛋白，易造成病毒大量聚集灭活不彻底，后来更换为BEI，据文献报道欧洲80年代前后发生几次ロ蹄疫与疫苗灭活不彻底有夫，欧盟于1990年停止使用疫苗。欧美等发达国家建有ロ蹄疫疫苗抗原库，用以配制紧急疫苗，但他们明确规定不能在本国生产灭活抗原，其保存抗原都是在非洲、南美等生产厂家生产灭活以后购进储藏的。位于英国的世界ロ蹄疫參考实验室周边曾在70年代发生过一次南非2型ロ蹄疫，据报道因实验室泄漏造成。据2005年世界ロ蹄疫參考实验室年度报告指出，近年来全世界C 型ロ蹄疫发生很少，2004年肯尼亚发生一次C型ロ蹄疫可能与当地使用疫苗有夫，鉴于此建议世界范围停止使用C型疫苗。2007年英国发生一次0型ロ蹄疫，分离毒株鉴定与1976年分离的实验室毒株OlBFS相近，本次暴发ロ蹄疫可能与发生地附近疫苗厂下水道泄漏有关。鉴于ロ蹄疫灭活疫苗采用强毒株生产，存在严重的安全隐患，本专利技术根据ロ蹄疫病毒的生物学特性，米用反向遗传操作技术，研发了 ロ蹄疫基因工程缺失弱毒株，该毒株缺失了 ロ蹄疫病毒毒力基因之一的L蛋白基因，L蛋白编码基因是ロ蹄疫病毒的主要毒力基因，该蛋白可以有效的阻断宿主细胞蛋白质的合成，特别是宿主病毒感染之后无法启动非特异性免疫应答一干扰素系统，该基因工程弱毒株对乳鼠、豚鼠等试验动物不致病，对ロ蹄疫毒易感动物毒力显著降低。在此弱毒株的基础上，我们删除了主要表面结构蛋白基因插入了ー个多克隆位点，构建了弱毒株ロ蹄疫感染性克隆为基础的ロ蹄疫病毒基因工程弱毒载体，可以将不同血清型(0、Asia1、A)强毒制苗种毒或田间分离强毒的任何ロ蹄疫病毒结构蛋白基因插入该ロ蹄疫病毒基因工程弱毒载体，转染细胞拯救出活病毒，该病毒維持致弱特性，并呈现所插入外源基因编码蛋白的抗原结构和免疫原性。用该毒株大量培养抗原制备疫苗，制备疫苗維持了疫苗生产毒株抗原性，但提高了疫苗制造过程中的生物安全性。ロ 蹄疫病韋(Foot-and-mouth disease virus)属小 RNA 病韋科(Picornaviridae) ロ疮病毒属(Aphthovirus),是人类发现最早的动物病毒。病毒粒子无囊膜，呈二十面体立体对称，直径约23-30nm，X线晶体衍射三维立体结构为表面相对光滑的球形，由60个分子的结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4包裹着ー个分子的RNA病毒基因组组成。ロ蹄疫病毒基因组RNA长约8. 3kb，为单股正链RNA，具有感染性，含有ー个长的开放读码框(0RF)，两侧为Y UTR和:V UTR0 ロ蹄疫病毒RNA 5' UTR比较长，大约1300nt，5'端无mRNA特有的帽结构，而共价连接ー个病毒编码多肽VPg (3B)。3' UTR由一段约IOOnt的序列和Poly (A)尾巴组成，与病毒RNA的感染性和稳定性、激活5' UTR IRES等有关。FMDV基因组中最长的部分是翻译约2330氣基酸聚蛋白的编码序列，其蛋白翻译和加工同时进行。ロ蹄疫病毒编码蛋白分为结构蛋白和非结构蛋白，按照基因组编码顺序分别为L蛋白、P1-2A衣壳前体蛋白、P2前体蛋白、P3前体蛋白，分别经病毒蛋白酶和宿主细胞蛋白酶加工成15种成熟蛋白。L蛋白具有自身切割功能，将其从Pl前体蛋白上解1 (Jakuo Kronovetr, I'lm Skern. Foot-and-moutn disease virus leader proteinase: apapain—like enzyme requiring an acidic environment in the a本文档来自技高网...
【技术保护点】
口蹄疫病毒重组载体的构建，其特征在于该载体的构建包括如下步骤：（1）口蹄疫病毒缺失L蛋白感染性克隆的构建是以口蹄疫病毒CHA90全长感染性克隆为基础，使用序列1和序列2所述一对引物及序列4和序列5所述一对引物通过重叠PCR扩增删除Lb基因，将PCR产物（序列7）克隆至pMD18?T载体（Takara产品），测序筛选阳性克隆，提质粒，以Xba?Ⅰ/Not?Ⅰ酶切连接到CHA90全长感染性克隆中构建而成，命名为p43?CHA90?LL；（2）结构蛋白基因的删除及酶切位点的引入是以CHA90全长感染性克隆质粒为模板，使用序列8和序列9所述一对引物及序列10和序列11通过重叠PCR扩增，删除结构蛋白P1大部分基因（VP2、VP3、VP1），同时通过同义突变引入酶切位点Ssp?Ⅰ、SgrA?Ⅰ，将PCR产物克隆至pMD18?T载体（Takara产品），测序筛选阳性克隆，提质粒，以Kpn?Ⅰ酶切连接至（1）项构建的p43?CHA90?LL中，构建获得的阳性克隆命名为p43?CHA90?LL?Vector，该重组载体p43?CHA90?LL?Vector已转入到大肠埃希氏菌中，该株带有p43?CHA90?LL?Vector的大肠埃希氏菌于2012年11月29日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC?No.6898。...
【技术特征摘要】
1.口蹄疫病毒重组载体的构建，其特征在于该载体的构建包括如下步骤 (1)口蹄疫病毒缺失L蛋白感染性克隆的构建是以口蹄疫病毒CHA90全长感染性克隆为基础，使用序列I和序列2所述一对引物及序列4和序列5所述一对引物通过重叠PCR扩增删除Lb基因，将PCR产物(序列7)克隆至pMDlS-T载体(Takara产品)，测序筛选阳性克隆，提质粒，以Xba I /Not I酶切连接到CHA90全长感染性克隆中构建而成，命名为P43-CHA90-LL ； (2)结构蛋白基因的删除及酶切位点的引入是以CHA90全长感染性克隆质粒为模板，使用序列8和序列9所述一对引物及序列10和序列11通过重叠PCR扩增，删除结构蛋白Pl大部分基因(VP2、VP3、VPl )，同时通过同义突变引入酶切位点Ssp1、SgrA I，将PCR产物克隆至PMD18-T载体(Takara产品)，测序筛选阳性克隆，提质粒，以Kpn I酶切连接至(I)项构建的P43-CHA90-LL中，构建获得的阳性克隆命名为p43-CHA90-LL-Vector，该重组载体p43-CHA90-LL_Vector已转入到大肠埃希氏菌中，该株带有p43-CHA90-LL_Vector的大肠埃希氏菌于2012年11月29日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为=CGMCCNo.6898...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵启祖，邹兴启，朱元源，徐璐，范学政，王琴，沈青春，王芳，宁宜宝，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：
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