本发明专利技术公开了茎瘤芥受体蛋白激酶类基因BjPERK1的核酸序列和氨基酸序列，以及植物表达载体和构建方法。本发明专利技术所构建的植物表达载体pCAMBIA1302-BjPERK1是由BjPERK1基因插入到pMD19-T，经Bgl?II和BstEII双酶切后连接到pCAMBIA1302的Bgl?II和BstE?II位点而得到的重组质粒。该植物表达载体用于植物遗传转化，BjPERK1基因在CaMV35S启动子的启动下超量表达，大量合成BjPERK1蛋白，从而提高植物耐盐性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及茎瘤芥抗逆基因BjPERKl及其植物表达载体和构建方法及应用。
技术介绍
高盐、干旱和低温等非生物胁迫对作物的产量及生长发育有很大影响，因此，有关植物抗逆性的研究一直是植物学研究领域的热点之一。莖瘤芥(Brassicajuncea var. tumida Tsen et Lee),又称青菜头，是十字花科 芸薹属植物，为榨菜的主要原料，是我国重庆、四川、浙江等地区主要的经济作物之一。多年来，茎瘤芥的相关研究主要集中在遗传育种、良种繁育、栽培技术、品质安全等领域，近年才陆续有生物学方面研究的报道，包括基因的克隆、功能研究以及茎瘤芥瘤状茎膨大相关研究，企图通过基因工程方法提高茎瘤芥的产量、质量以及抗病性、抗逆性等。近年来对植物受体蛋白激酶(receptor protein kinase, PERK)类基因的研究表明，它们可能参与了植物细胞抗逆反应、植物形态发生、自交不亲和等生理生化反应。而本实验室(重庆邮电大学分子生物学实验室)对茎瘤芥永安小叶品种的瘤茎膨大前后的转录组测序获得了序列SEQ ID NO. 3，该序列有303bp，经NCBI的blastx比对，预测为受体蛋白激酶蛋白基因(本专利技术将其命名为BjPERKl)片段，而BjPERKl基因的功能是什么，是否可以增强植物抗逆性，于是本专利技术将通过RACE扩增获得全长序列和植物表达载体构建与遗传转化，希望获得该基因的具体功能以便能够通过对茎瘤芥的基因工程改造获得更好的品种。对于茎瘤芥受体蛋白激酶基因BjPERKl，目前还未见其全基因序列以及基因功能的报道，而本专利技术经实验验证，该基因蛋白具有提高植物抗逆性的作用，促进了植物在逆境条件下的适应能力和生长能力。
技术实现思路
鉴于此，本专利技术的目的之一是提供茎瘤芥抗逆基因BjPERKl，其核苷酸序列为SEQID NO.1所示，该基因全长2252bp，通过NCBI的ORF工具检测知其最大开放阅读框1923bp，5’端非编码区有99bp，3’端非编码区有230bp。本专利技术的目的之二是提供茎瘤芥抗逆基因蛋白BjPERKl，其氨基酸序列为SEQ IDNO. 2所示,有640个氨基酸,且序列通过NCBI的保守结构域(conserved domains)检测知具有蛋白激酶催化结构域。本专利技术的目的之三是提供茎瘤芥抗逆基因BjPERKl的重组植物表达载体pCAMBIA1302-BjPERKl，其由抗逆基因BjPERKl的最大开放阅读框序列(编码序列)与植物表达载体pCAMBIA1302构成。本专利技术的目的之四是提供茎瘤芥抗逆基因BjPERKl的重组植物表达载体PCAMBIA1302-BJPERK1的构建方法，包括如下步骤(I)茎瘤芥抗逆基因BjPERKl的克隆A. BjPERKl基因5’端未知序列扩增根据序列SEQ ID NO. 3设计两个反向巢式引物BjPERKl-AOUT :5’-AGTCCTTTAGCAGATCCAAGAGCA-3’BjPERKl-AIN :5’-AATCTGGTGCTCCATTCCATTGTA-3’ ； 提取茎瘤芥茎的总RNA，然后通过5’ -Full RACE Kit试剂盒方法获得cDNA第一链并进行巢式PCR扩增，产物连接到pMD19-T载体，转化DH5 α感受态细胞，筛选并测序获得5’端序列；B. BjPERKl基因3’端未知序列扩增根据序列SEQ ID NO. 3设计两个正向巢式引物BjPERKl-SOUT :5’-TGCTTGTCTATGAGTTTGTTCCTA-3’BjPERKl-SIN :5’-GCAATCCTAAAATCATTCACCGTG-3’提取茎瘤芥茎的总RNA，然后用接头引物5’ -ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d (T)30MN-3’ (N=A, G, C或T;M=A，G或C ；d(T) 30代表30个连续的T碱基)以及M-MLV反转录酶反转获得cDNA第一链并进行巢式PCR扩增，产物连接到pMD19-T载体，转化DH5 α感受态细胞，筛选并测序获得3’端序列；C. BjPERKl基因全长序列扩增将所述获得的5’端序列、3’端序列与序列SEQ ID NO. 3拼接，并从5’端非翻译区和3’端非翻译区设计一对引物上游引物BjPERKl-F :5’ -CGTGTCTCCTCTCTCCTCCTGCTT-3’下游引物BjPERKl-R :5’-AACCTTCAATTTCTCTCCCATCTG-3’ ；再以步骤B中的cDNA第一链为模板进行PCR扩增，产物连接到pMD19_T载体，转化DH5 α感受态细胞，筛选并测序获得BjPERKl基因全长序列；(2)植物表达载体 pCAMBIA1302_BjPERKl 的构建根据BjPERKl基因的开放阅读框序列设计一对引物，并分别引入酶切位点Bgl II和BstE II序列上游引物BjPERKl-Bgl :5’ -AGATCTATGTCCTCGGCGCCGTCT-3’ ；下游引物BjPERKl-Bst :5’ -GGTAACCTTACAAAAAAGGGCCACTAT-3，；再以步骤(I)B中的cDNA第一链为模板进行PCR扩增，产物连接到pMD19-T载体得重组质粒pMD19-T-BjPERKl，转化DH5 α感受态细胞；提取质粒pMD19-T_BjPERKl和PCAMBIA1302，并用Bgl II和BstE II双酶切后连接，转化，筛选并测序验证，植物表达载体pCAMBIA1302-BjPERKl 构建成功。本专利技术的目的之五是提供茎瘤芥抗逆基因BjPERKl在提高植物耐旱特性的应用。本专利技术根据已知序列SEQ ID NO. 3设计巢式引物并通过RACE方法扩增获得茎瘤芥第一个受体蛋白激酶类基因BjPERKl ;通过构建茎瘤芥BjPERKl基因植物表达载体，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，创制耐盐新种质，提高植物的耐盐抗性，可进行植物品种改良。附图说明图1为本专利技术BjPERKl基因5’端序列扩增的凝胶电泳图；图2为本专利技术BjPERKl基因3’端序列扩增的凝胶电泳图；图3为本专利技术BjPERKl基因最大开放阅读框序列扩增的凝胶电泳图；图4为本专利技术重组植物表达载体pCAMBIA1302_BjPERKl的构建 流程图；图5为本专利技术正常条件下野生型与转基因型拟南芥发芽率的统计图；图6为本专利技术NaCl胁迫下野生型与转基因型拟南芥发芽率的统计图；图7为本专利技术NaCl胁迫下野生型与转基因型拟南芥根的长度统计图；图8为本专利技术NaCl胁迫下野生型与转基因型拟南芥的根的摄影图；图9为本专利技术NaCl胁迫下野生型与转基因型拟南芥的存活率统计图。具体实施例方式下面将结合实施例和附图来详细说明本专利技术，这些实施例和附图仅起说明性作用，并不局限于本专利技术的应用范围。本专利技术不限于下述实施方式或实施例，凡不违背本专利技术精神所做出的修改及变形，均应包括在本专利技术范围之内。实验例1:茎瘤芥抗逆基因BjPERKl的克隆I主要试剂柱式小量植物总RNA抽提试剂盒(W7021)购自上海华舜生物技术有限公司；DNA纯化回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；5’ -Full RACE Kit试剂盒、M-MLV反转录酶、Premix Ex Taq>本文档来自技高网...
【技术保护点】
茎瘤芥抗逆基因BjPERK1，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ?ID?NO.1所示，全长序列2252bp，最大开放阅读框1923bp，5’端非编码区有99bp，3’端非编码区有230bp。
【技术特征摘要】
1.茎瘤芥抗逆基因BjPERKl，其特征在于其核苷酸序列为SEQID NO.1所示，全长序列2252bp，最大开放阅读框1923bp，5’端非编码区有99bp，3’端非编码区有230bp。2.茎瘤芥抗逆基因蛋白BjPERKl，其特征在于其氨基酸序列为SEQID NO. 2所示。3.茎瘤芥抗逆基因BjPERKl的重组植物表达载体pCAMBIA1302-BjPERKl，其特征在于由权利要求1所述的抗逆基因BjPERKl的最大开放阅读框序列与植物表达载体PCAMBIA1302 构成。4.权利要求3所述的茎瘤芥抗逆基因BjPERKl的重组植物表达载体PCAMBIA1302-BJPERK1的构建方法，其特征在于包括如下步骤 (1)茎瘤芥抗逆基因BjPERKl的克隆 A.BjPERKl基因5’端未知序列扩增 根据序列SEQ ID NO. 3设计两个反向巢式引物BjPERKl-AOUT :5’ -AGTCCTTTAGCAGATCCAAGAGCA-3’BjPERKl-AIN :5’-AATCTGGTGCTCCATTCCATTGTA-3’ ； 提取茎瘤芥茎的总RNA，然后通过5’ -Full RACE Kit试剂盒方法获得cDNA第一链并进行巢式PCR扩增，产物连接到pMD19-T载体，转化DH5 α感受态细胞，筛选并测序获得5’端序列； B.BjPERKl基因3’端未知序列扩增 根据序列SEQ ID NO. 3设计两个正向巢式引物BjPERKl-SOUT :5’-TGCTTGTCTATGAGTTTGTTCCTA-3’BjPERKl-SIN :5’-GCAATCCTAAAATCATTCACCGTG-3’ 提取茎瘤芥茎的总RNA，然后用接头引物和反转录酶反转获得cDNA第一链并进行巢式PCR扩增，产物连接到PMD19-T载体，转化DH5 α感受态细胞，筛选并测序获得3’端序列； C.BjPE...
【专利技术属性】
技术研发人员：向浏欣，蔡应繁，付于银，刘吉军，冉燕子，王秋娟，王小艳，
申请(专利权)人：重庆邮电大学，
类型：发明
国别省市：
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