一种白桦叶片基因组DNA提取方法技术

本发明专利技术公开了一种白桦叶片基因组DNA提取方法，改良了CTAB与STE溶液；采用常温下等体积的改良CTAB溶液和STE溶液洗涤充分研磨的材料2次；水浴裂解温度由65℃提高至70℃；在沉淀DNA时，采用无水乙醇:异丙醇(体积比为2:1)混合沉淀剂，低速离心，以降低杂质的沉淀。这种方法能分离出高质量的白桦叶片基因组DNA。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及的是一种高质量白桦叶片基因组DNA提取方法。
技术介绍
高纯度基因组DNA是基因组测序、基因克隆、分子杂交、基因文库构建和分子标记等一系列分子生物学研究的前提。白桦叶片中酚类、多糖、萜类等次生物质含量较高，特别是生长在我国东北白桦，由于要适应东北地区较为严酷的地理及气候环境，体内各种次生物质种类更多、含量更高，会对DNA的提取造成更为严重的影响。因此，如何去除这些杂质以获得高质量的DNA是白桦叶片基因组DNA提取过程中面临的主要问题，也是对白桦进行分子生物学研究的前提条件。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种高质量白桦叶片基因组DNA提取方法。本专利技术的技术方案如下①叶片在加液氮的研钵中研磨至细末后，加入300 U L改良STE溶液，300 y L改良CTAB溶液(改良STE溶液和改良CTAB溶液等体积)和20 y L P —巯基乙醇，混合后震荡3min ;改良 CTAB 溶液配方2. 5 % (ff/V)CTAB, 150mmol/LTris-Cl (pH8. 0),20mmol/L EDTA(pH8. 0),1. 4mmol/L NaCl ;改良SET溶液配方150mmol/L Tris-Cl(pH8. 0),20mmol/L EDTA(pH8. 0),1. 4mmol/LNaCl ；②常温5000g离心5min，弃上清；向沉淀中加入加600 y L改良CTAB溶液和20 u L ^ 一疏基乙醇70°C水浴15min后16060g离心5min ；③取上清加入等体积氯仿充分混勻，16060g离心5min,重复此步骤2次；④取上清加入等体积的无水乙醇异丙醇混合液(体积比为2:1)，上下颠倒混合均勻后常温下静置3min,6080g离心3min ；⑤倒掉上清液，用70%预冷的乙醇洗涤2 3次，干燥后溶于50 ii L TE或去离子水中；⑥电泳检测DNA的完整性，A260/280测定DNA浓度和纯度。本专利技术的提取方法方法能提取出高质量白桦叶片基因组DNA，其核心技术包括以下几个内容1、改良了 CTAB与STE溶液；2、采用常温下等体积的改良CTAB溶液和STE溶液洗涤经充分研磨的材料2次；3、水浴裂解温度由65°C提高至70°C ;4、在沉淀DNA时，采用无水乙醇异丙醇(体积比为2:1)混合沉淀剂，低速离心，以降低杂质的沉淀。这种方法能分离出高质量的白桦叶片基因组DNA。附图说明图1为不同方法提取的白桦DNA电泳结果；1、2泳道为CTAB法提取的DNA ;3、4泳道为SDS法提取的DNA ;5、6泳道方法III提取的DNA电泳；7泳道方法IV (STE洗涤I次)提取的DNA ；8泳道方法V (CTAB洗涤I次)提取的DNA ；图2为方法IV提取的白桦DNA电泳结果；1.和2泳道为STE和CTAB洗涤混合液洗涤I次后提取的白桦基因组DNA ；3.和4泳道STE和CTAB洗涤混合液洗涤I次后提取的白桦基因组DNA ；5.和6泳道为STE和CTAB洗涤混合液洗涤2次后提取的白桦基因组DNA ；图3为方法IV提取的白桦DNA EcoR I与MseI酶切电泳结果；1.为白桦叶片基因组DNA;2.白桦叶片基因组DNA被EcoR I酶切后电泳结果；3.白桦叶片基因组DNA被MseI酶电泳切结果；4.标准DNA分子量；5 7泳道为重复；图4为白桦不同个体叶片基因组DNA的RAH)扩增结果。具体实施方式 以下结合具体实施例，对本专利技术进行详细说明。材料白桦叶片取自东北林业大学校园内已达开花结实的白桦，于8月未摘取的成熟叶片，叶片保存在_20°C冰箱。试剂CTAB 溶液(2 % (ff/V)CTAB, IOOmmoI/L Tris-Cl(pH8. 0), 20mmol/LEDTA(pH8. 0),1.4mmol/LNaCl)STE 溶液(IOOmmo 1/L Tris-Cl (pH8. 0),20mmol/L EDTA (pH8. 0)，改良CTAB 溶液(2. 5 % (W/V)CTAB，150mmol/L Tris-Cl (pH8. 0), 20mmol/L EDTA(pH8. 0),1. 4mmol/LNaCl)；改良SET 溶液(150mmol/L Tris-Cl (pH8. 0), 20mmol/L EDTA (pH8. 0),1. 4mmol/LNaCl)；其他试剂40mmol/L疏基乙醇，lOOmmol/L Tris HCI (pH8. 0), 20mmol/LEDTA,10%SDS, IOmo 1/L LiCI (高压灭菌)，氯仿 / 异戊醇(24 :1)，Tris 饱和酚，5mol/L KAC，TE 缓冲液。EcoRI和MseI酶购自纽英伦公司。其他均为常规国产试剂。主要仪器和设备凝胶成像系统(UVP)，MIKR0120微量台式高速离心机(Hettich) ,-20°C超低温冰箱(Harris),-40°C低温冰箱(海尔公司),超纯水仪(Milipore)；DYY-1I1-12B型三恒多用电泳仪(六一仪器厂)，可见紫外分光光度计(ABI);涡旋振荡器GL-88B (江苏海门麒麟医用仪器厂)。1. DNA提取方法方法1:常规的CTAB法参照王关林等的《植物基因工程》。方法I1:SDS法参照顾洪雅的方法。方法III①向1. 5 ii L的无菌离心管加600 U LCTAB裂解液和20 ii L @ -巯基乙醇，65°C浴热5min。②从-20°C取出材料后加液氮研磨至材料成灰白色，向步骤①中的每个离心管中加约0. 04g材料，剧烈震荡混匀，65°C浴热lOmin。③随后加入1/3体积5mol/L KAC(pH8. 0)，充分混匀。再加入200 u LTris饱和酚(pH9. 5)和300 u L氯仿。轻轻震荡IOmin。④常温16060g离心lOmin，取600ii L上清液加入等体积的酚(同上)氯仿(3 1)，轻轻震荡5min。⑤常温16060g离心lOmin，取600 ii L上清液加适量无水乙醇，再加入等体积氯仿后震汤5min。⑥常温16060g离心lOmin，取上清加入2/3体积异丙醇，轻轻混匀3min。⑦常温6080g离心5min，去上清液后加适量水溶解，加入1/10体积3mol/LNaAC和2. 5倍体积乙醇_20°C沉淀30min。⑧常温6080g离心lOmin，去上清液后用70%酒精洗涤2 3次，室温或真空干燥后加55 u LTE溶解。电泳检测DNA的完整性，A2607280测定DNA浓度和纯度。方法IV:①叶片在加液氮的研钵中研磨至细末后，向1. 5 ii L的无菌离心管加600 U LSTE和20 u 一巯基乙醇混合震荡3min。常温5000g离心5min,弃上清；向下层沉淀中加入600 u L CTAB后剧烈振荡混匀，65°C浴热IOmin;再加入400 u L Tris饱和酚(pH9. 5)和200 u L氯仿，轻轻振荡IOmin。②常温16060g离心lOmin，取600ii L上清液加入等体积的酚(同上)氯仿(3 1)，轻轻震荡5min。③常温16060g离心lOmin，取600 ii L上清液加适量无水本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种白桦叶片基因组DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：①叶片在加液氮的研钵中研磨至细末后，加入300μL改良STE溶液，300μL改良CTAB溶液和20μLβ—巯基乙醇，混合后震荡3min；改良CTAB溶液配方：2.5﹪（W/V）CTAB，150mmol/L?Tris?Cl（pH8.0），20mmol/L?EDTA（pH8.0），1.4mmol/L?NaCl；改良SET溶液配方：150mmol/L?Tris?Cl（pH8.0），20mmol/L?EDTA（pH8.0），1.4mmol/L?NaCl；②常温5000g离心5min,弃上清；向沉淀中加入加600μL改良CTAB溶液和20μLβ—巯基乙醇70℃水浴15min后16060g离心5min；③取上清加入等体积氯仿充分混匀，16060g离心5min，重复此步骤1~2次；④取上清加入等体积的无水乙醇:异丙醇混合液，无水乙醇:异丙醇的体积比为2:1，上下颠倒混合均匀后常温下静置3min，6080g离心3min；⑤倒掉上清液，用70%预冷的乙醇洗涤2~3次，干燥后溶于50μL?TE或去离子水中；⑥电泳检测DNA的完整性，A260/280测定DNA浓度和纯度。...

【技术特征摘要】
1. 一种白桦叶片基因组DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤①叶片在加液氮的研钵中研磨至细末后，加入300μ L改良STE溶液，300 μ L改良CTAB 溶液和20 μ Li3 —巯基乙醇，混合后震荡3min ;改良CTAB溶液配方2. 5 % (W/V) CTAB， 150mmol/L Tris-Cl (pH8. 0),20mmol/L EDTA (pH8. 0),1. 4mmol/L NaCl ;改良 SET 溶液配方150mmol/L Tris-Cl (pH8. 0),20mmol/L EDTA (pH8. 0),1. 4mmol...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏志刚，杨传平，张力杰，曲赞霜，候聪，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：