与黄瓜苦味性状相关的SNP标记及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种与黄瓜苦味性状相关的SNP标记及其应用，其位于编码黄瓜Csa6G088690蛋白的基因序列第1178bp处，此处碱基为G的黄瓜苦味，此处碱基为A的黄瓜不苦。本发明专利技术采用全基因组关联分析的方法（GWAS）筛选到与黄瓜苦味性状相关的SNP标记，并通过衍生的酶切扩增多态性序列（dCAPS）的方法来检测待测黄瓜的基因型，根据基因型进行苦味或不苦黄瓜品种的选育，从而加快无苦味黄瓜的育种进程。与传统的以主观方式判断黄瓜是否具有苦味的方法相比，结果更加准确可靠，比采用HPLC鉴定苦味物质更简单、便捷，可用于大规模筛选育种材料。另外，本发明专利技术首次发现黄瓜Csa6G088690蛋白控制着黄瓜苦味合成通路中的关键步骤。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及一种与黄瓜苦味性状相关的SNP标记及其应用。
技术介绍
黄瓜的苦味是由一类称为葫芦素C的三萜化合物导致的。黄瓜果实中积累葫芦素C会严重影响黄瓜的商品品质。早期的经典遗传试验发现黄瓜的苦味有Bi和Bt两个基因控制。Bi基因主要控制叶片苦味，Bt基因主要控制黄瓜果实苦味。其中隐性bi基因对Bt基因具有上位效应。但到目前为止，Bi和Bt基因均未被克隆出来。育种学家们为了避免苦味对黄瓜品质的干扰，在育种过程中往往依靠品尝或是经验等主观评价方式来鉴定黄瓜 品种的苦味。此外，黄瓜叶片或果实的葫芦素C含量也可以用HPLC进行准确测量，据此判断黄瓜是否具有苦味。依靠经验或品尝等主观评价方式来判断黄瓜是否具有苦味非常不科学，受个体差异影响较大，不同个体对苦味的反应不尽相同，难以确保结果准确。而利用HPLC测量葫芦素C的方法结果虽然准确，但测量费用高且样品准备繁琐。育种学家们在选育不苦育种材料时需对成千上万的材料进行鉴定，没有可操作性，因此该方法一直没有被采用，仅用于小规模的科学研究。随着分子数量遗传学、分子生物学技术的飞速发展，有关分子遗传标记和标记辅助选择的研究被广泛开展，并在植物育种中应用，产生了巨大的影响。dCAPS (衍生的酶切扩增多态性序列，derived cleaved amplified polymorphic sequences)是在 PCR 技术基础上发展起来的，其基本原理是用PCR扩增目的DNA片段，通过在扩增引物中引入错配碱基，结合SNP位点引入新的限制性内切酶作用位点，用特异性限制性内切酶消化切割成不同大小片段，直接利用凝胶电泳图进行分析。用dCAPS法可以将几乎所有的SNP位点转化成以PCR为基础的分子标记。分子育种，即分子标记辅助选择育种，是指利用DNA分子标记对育种材料进行选择，综合改良作物的重要经济性状，是传统遗传育种与现代分子生物学有机结合的育种方法。分子育种为农作物育种开辟了一条新的途径，随着现代生物技术的发展，分子标记在农作物育种中的作用将日益突出。在黄瓜育种中，人们希望选择与黄瓜苦味性状密切相关的DNA标记，以实现早期选种和提高育种准确性的目标，从而加快遗传育种进程。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种与黄瓜苦味性状相关的SNP标记及其应用。本专利技术的另一目的是提供用于检测所述与黄瓜苦味性状相关的SNP标记的引物对及含有该引物对的试剂盒。为了实现本专利技术目的，本专利技术首先提供一种黄瓜Csa6G088690蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本专利技术还提供编码所述Csa6G088690蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。本专利技术还提供含有编码所述Csa6G088690蛋白的基因的载体。本专利技术还提供含有编码所述Csa6G088690蛋白的基因的转基因细胞系。本专利技术还提供含有编码所述Csa6G088690蛋白的基因的工程菌。本专利技术还提供含有编码所述Csa6G088690蛋白的基因的转化植物细胞。 本专利技术还提供编码所述Csa6G088690蛋白的基因在葫芦素合成中的应用。本专利技术还提供编码所述Csa6G088690蛋白的基因在调控黄瓜苦味性状中的应用。进一步地，本专利技术提供一种与黄瓜苦味性状相关的SNP标记，其位于黄瓜Csa6G088690基因序列第1178bp处，此处碱基为G的黄瓜苦味，此处碱基为A的黄瓜不苦。本专利技术还提供用于检测上述与黄瓜苦味性状相关的SNP标记的引物对，包括正向引物 F5’ -GAAGATGAAAATAGTCGATATAGAT-3’和反向引物 R5’ -ATGATATGAATTGCTAGCTAGTTCT-3，。本专利技术还提供上述与黄瓜苦味性状相关的SNP标记在鉴定苦味黄瓜品种中的应用，其包括步骤I)提取待测黄瓜的基因组DNA ；2)以待测黄瓜的基因组DNA为模板，利用上述引物对F和R，进行PCR扩增反应； 3 )检测PCR扩增产物。其中，PCR反应使用的扩增体系以20 μ I计为10_20ng/ μ I模板DNAl μ 1，lOpmol/μ I 引物 F 和 R 各 I μ 1，10mmol/L dNTP mix O. 4 μ I，O. 5U/μ L TaqDNA 聚合酶0.3μ , 10XPCR反应缓冲液2 μ 1，余量为水。PCR反应条件为94 V 5分钟；94 V 20秒，55 V 20秒，72 V 30秒，35个循环；72 °C 10 分钟。步骤3)采用dCAPS法，具体为用内切酶EcoR V对PCR扩增产物进行酶切，并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果检测结果仅为一条208bp大小的条带，则待测黄瓜属于苦味黄瓜品种，检测结果为一条182bp大小的条带，则待测黄瓜属于普通品种。本专利技术还提供含有上述引物F和R的用于检测黄瓜苦味性状的试剂盒。优选所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。更优选所述试剂盒还包括标准阳性模板。本专利技术提供了一种与黄瓜苦味性状相关的SNP标记及其应用，即根据基因型进行苦味或不苦黄瓜品种的选育，从而加快黄瓜的育种进程。首先对114份黄瓜核心种质材料进行重测序分析，同时对这114份材料进行苦味表型鉴定。采用全基因组关联分析(GffAS )的方法，从100万个SNP中找到了一个与苦味表型相关的SNP位点(图1)。该SNP位点位于编码Csa6G088690蛋白的基因序列第1178bp处，G突变为A，该突变导致Csa6G088690蛋白的393位氨基酸从半胱氨酸变为酪氨酸。即102份苦的黄瓜材料在该位点都是G，12份不苦的黄瓜在该位点都是A。为了进一步验证该SNP与苦味性状的相关性，采用叶片苦的黄瓜9930与叶片不苦的黄瓜9110GT构建了一个由1800个单株组成的F2群体。用酶切的方法对1800个单株的表型进行鉴定，结果显示该SNP位点完全与苦味表型连锁(图2)，符合预期。进一步分析发现，黄瓜Csa6G088690蛋白与西葫芦中的CPQ具有很高的同源性，CPQ能够环化氧化角鲨烯生成葫芦2烯醇，是合成葫芦素通路中的关键步骤。此外，Csa6G088690基因在黄瓜第6号染色体上的位置正好位于Bi基因所处的区域。根据以上结果，推测Csa6G088690基因很可能就是之前一直寻找的控制黄瓜苦味的Bi基因，而突变的Csa6G088690 (C393Y)即bi基因。为了证实这一推论，专利技术人利用酵母和烟草外源表达系统，对Csa6G088690基因的功能进行鉴定，结果发现，Csa6G088690蛋白能够环化氧化角鲨烯生成葫芦2烯醇，而突变的Csa6G088690 (C393Y)完全丧失了环化酶的功能。另一方面，专利技术人进行了转基因恢复试验，将正常的Csa6G088690基因转入不苦的黄瓜材料中，转化后该材料变苦，LC-q-TOF检测有苦味生成。综上所述，Csa6G088690即Bi基因，控制着黄瓜苦味合成通路中的关键步骤。本专利技术可替代传统的以主观方式判断黄瓜是否具有苦味的方法，完全排除人为因素的影响，使结果更加准确可靠。比采用HPLC鉴定苦味物质更简单、便捷本文档来自技高网...

【技术保护点】
黄瓜Csa6G088690蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.黄瓜Csa6G088690蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。2.编码权利要求1所述蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQID No. 2所示。3.含有权利要求2所述基因的载体。4.含有权利要求2所述基因的转基因细胞系。5.权利要求2所述的基因在葫芦素合成中的应用。6.—种与黄瓜苦味性状相关的SNP标记,其特征在于,其位于编码黄瓜Csa6G088690蛋白的基因序列第1178bp处，此处碱基为G的黄瓜苦味，此处碱基为A的黄瓜不苦；所述编码黄瓜Csa6G088690蛋白的基因序列如SEQ ID No. 2所示。7.用于检测权利要求6所述与黄瓜苦味性状相关的SNP标记的引物对，其特征在于，包括正向引物 F5’ -GAAGATGAAAATAGTCGATATAGAT-3’和反向引物 R5’ -ATGATATGAATTGCTAGCTAGTTCT-3，。8.权利要求6所述与黄瓜苦味性状相关的SNP标记在鉴定苦味黄瓜品种中的应用，其包括步骤 1)提取待测黄瓜的基因组DNA； 2)以待测黄瓜的基因组DNA为模板，利用权利要求7...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄三文，尚轶，张忠华，李颖，马永硕，齐建建，王深浩，王晔，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：