本发明专利技术公开了一种用于生物酶固定化的核壳式超顺磁性聚合物微球及其制备方法，属于生物技术领域。本发明专利技术用亲水性更强的SiO2对超顺磁性的Fe3O4纳米粒子进行完全包覆，然后用反相悬浮聚合技术制备以Fe3O4纳米粒子为核和表面含有环氧基团的聚合物为壳的核壳式的超顺磁性聚合物微球。将上述核壳式超顺磁性聚合物微球可用于青霉素酰化酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖转苷酶、胰蛋白酶或淀粉酶等水溶性生物酶的固定化，特别适用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固定化酶活性为430U/g(湿酶)，经过10次循环使用后，固定化酶保留了99％的初始活性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于生物酶固定化的核壳式超顺磁性聚合物微球及其制备方法，属于生物
具体地说，采用反相悬 浮聚合法制备了比表面积大、球形度好、粒径分布均勻和表面含有环氧基团的核壳式超顺磁性聚合物微球。
技术介绍
酶是ー类由生物活体细胞产生的具有催化性能的蛋白质，故又称为生物催化剂。它能在十分温和条件下高效催化各种化学反应，因而无论在实验室还是エ业上都是ー种常用的催化剂。但是游离酶在催化反应过程中存在以下两方面的弊端第一，在热、强酸、强碱、高离子强度和有机溶剂中，酶的催化活性会大大下降甚至丧失；第二，作为ー类液体催化剂，在水溶液中进行反应，反应结束之后，催化剂与底物和产物分离困难，不利于催化剂的循环利用和提高产物的纯度，以上两方面大大限制了游离酶在连续化大規模生产中的应用。酶的固定化技术是ー种将酶从均相催化状态转变成为多相催化状态的方法，将酶固定在特定的载体上制成固定化酶，不仅大大提高了酶的热稳定性和酸碱稳定性，而且固定化酶容易与产物和底物分离，提高了产物纯度的同时也实现了酶的重复利用，在生产过程中容易实现连续操作。青霉素酰化酶(EC3. 5.1. 11)是半合成P -内酰胺类抗生素生产中最关键的酶，它既能催化青霉素及其扩环酸水解去侧链，生产半合成￠-内酰胺类抗生素的重要中间体6_氨基青霉烷酸出-APA)和7-氨基-3-脱こ酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)，又能催化6-APA和7-ADCA与侧链缩合,生产多种半合成P -内酰胺类抗生素(如Ampicillin, Amoxicillin,Cephalexin和Cefadroxil等)。6-APA可以由青霉素酰化酶水解法和化学合成法生产,青霉素酰化酶水解法具有专ー性强、反应条件温和、无污染等优点，而化学合成法反应过程复杂、反应条件苛刻，需在_40°C和高毒性的卤代溶剂中进行，易造成环境污染，不符合緑色化学的要求。因此，青霉素酰化酶水解法具有高效、经济和环保等优点，成为生产6-APA的首选方法。磁性聚合物微球的性质及其合成方法的研究已成为近十多年来新材料研究中的热点。磁性聚合物微球结合了磁性粒子和高分子聚合物的特性，磁性粒子使材料具有一定的磁响应性，能在外加磁场的作用下实现迅速地简单分离，同时包覆的聚合物赋予材料一定的吸水性和弾性，并可通过共聚、改性等手段使材料表面带有特定的能与生物活性物质相结合的官能团，从而使磁性聚合物微球在固定化酶、细胞分离、靶向药物和免疫分析等方面都具有极其诱人的发展前景。同时，对于表面含有环氧基团的聚合物微球，环氧基团能够在室温条件下开环与酶的活性非必需侧链基团反应形成共价键，因酶与载体之间以共价键相结合，呈现良好的操作稳定性。中国专利技术专利CN101183589A公开了ー种带有表面官能团的磁性微球的制备方法，在磁性纳米粒子存在的条件下进行分散聚合，聚合反应结束后对磁性微球表面进行磺化使其表面带上官能团。由于聚合物是疏松的且带有大孔结构，在聚合反应过程中即使将Fe3O4粒子包覆在聚合物内部，但在聚合反应结束后用98%的浓硫酸进行磺化时，硫酸难免会通过聚合物的疏松孔道进入微球内部和Fe3O4反应使磁性粒子被破坏。中国专利技术专利CN101085874A公开了ー种亲水性聚合物磁性微球及其制备方法和用途。用甲酰胺分散超顺磁性Fe3O4磁粉制备磁流体，与亲水性単体混合组成聚合相，搅拌下分散于含有稳定剂的疏水性有机溶剂形成悬浮相，用反相悬浮聚合技术制备了亲水性聚合物磁性微球。用上述磁性微球制备的固定化青霉素酰化酶的最高表观活性可达795IU/g (370C，载体干重)，相当于205IU/g (28°C，载体湿重)。但该专利技术的制备方法存在着硬脂酸钙稳定剂洗涤困难和聚合物磁性微球机械强度低等缺点，严重影响了固定化酶的表观活性和使用寿命。中国专利技术专利CN101250247A公开了ー种用于生物酶固定化的磁性聚合物微球及其制备方法。将超顺磁性的Fe3O4纳米粒子、含环氧基团的单体和交联剂等分散在甲酰胺溶液中制成单体相，在搅拌下加入到用Span60和Tween20复合表面活性剂稳定的分散相 中进行反相悬浮聚合，制备表面带有环氧基团的磁性聚合物微球。该专利技术用TWeen20代替CN101085874A中的硬脂酸钙，提高了固定化酶的活性，简化了后处理的操作。但是在该专利技术中，纳米级的磁性粒子具有较高的表面能，在聚合反应过程中分散性不好，极易团聚成大颗粒，使制备得到的磁性聚合物微球中磁含量不等、粒径分布不均匀和形貌不均一，同时磁性粒子与聚合单体之间的亲和性不好会使部分磁性粒子不能很好地被包埋于聚合物基质内部形成核壳式结构，降低了磁性聚合物微球的比表面积，从而降低了固定化青霉素酰化酶的活性(只有330U/g，28 °C，载体湿重)。
技术实现思路
本专利技术目的是为了克服现有技术存在的缺陷而提供一种制备比表面积大、球形度好、粒径分布均匀和表面含有环氧基团的核壳式的超顺磁性聚合物微球的方法，使以该聚合物微球为载体制备的固定化青霉素酰化酶具有较高的活性、操作稳定性和磁分离性能。本专利技术目的可以通过以下技术方案来实现先用亲水性更强的SiO2包覆超顺磁性的Fe3O4纳米粒子，然后将其分散于极性溶剂中形成磁流体，再加入含有环氧基团的功能性単体和交联剂，在引发剂作用下利用反相悬浮聚合技术制备核壳式的超顺磁性聚合物微球。所述的超顺磁性的Fe3O4纳米粒子用共沉淀法制备，将氯化铁和硫酸亚铁溶于去离子水中，在N2保护下加热至一定温度后用氨水调节体系pH值为10 11，继续熟化I 3h，冷却至室温，用去离子水反复洗涤沉淀至中性。所述的Fe3+盐和Fe2+盐的摩尔比为2 :1 1: 1，反应温度为35 85°C。所述的超顺磁性的Fe304/Si02纳米粒子的制备方法，将上述Fe3O4纳米粒子分散到由无水こ醇、去离子水和氨水组成的混合溶剂中，超声分散15 45min后加入正娃酸こ酷，在室温下继续反应8 16h后，用去离子水反复洗涤沉淀至中性后于50 80°C真空干燥8 16h。所述的正硅酸こ酯和Fe3O4纳米粒子的质量比为1: 2 2 :1。所述的核壳式的超顺磁性聚合物微球用反相悬浮聚合技术制备，将Fe304/Si02纳米粒子分散到溶解有N，N’ -亚甲基双丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸缩水甘油酯和烯丙基缩水甘油醚等聚合物单体以及偶氮ニ异丁腈引发剂的甲酰胺溶液中，然后加入到溶解有Span60和TWeen20复合分散剂(质量比为8 3)的由正庚烷和四氯こ烯组成的混合溶剂(体积比为3 I)中，在氮气保护下于55°C进行反相悬浮聚合反应4h，反应结束后用こ醇洗涤，正庚烷浸泡，60°C真空干燥12h。所述的Fe304/Si02纳米粒子的加入量为聚合物单体总质量的2% 10%。所述的核壳式的超顺磁性聚合物微球，可用于青霉素酰化酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖转苷酶、胰蛋白酶和淀粉酶等水溶性生物酶的固定化，特别适用于青霉素酰化酶的固定化。采用中国专利技术专利CN101250247A中的固定化青霉素酰化酶的活性测定方法，测定以上述核壳式的超顺磁性聚合物微球为载体制备的固定化酶的活性。经过10次循环使用后的固定化酶的操作稳定性定义为第10次循环使用后的固定化酶的活性与初始活性之比。本专利技术的关键在于用亲水性更本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于生物酶固定化的核壳式超顺磁性聚合物微球的制备方法，其特征在于，用亲水性更强的SiO2对超顺磁性的Fe3O4纳米粒子进行完全包覆，然后用反相悬浮聚合技术制备以Fe3O4纳米粒子为核和表面含有环氧基团的聚合物为壳的核壳式的超顺磁性聚合物微球。
【技术特征摘要】
1.一种用于生物酶固定化的核壳式超顺磁性聚合物微球的制备方法，其特征在于，用亲水性更强的SiO2对超顺磁性的Fe3O4纳米粒子进行完全包覆，然后用反相悬浮聚合技术制备以Fe3O4纳米粒子为核和表面含有环氧基团的聚合物为壳的核壳式的超顺磁性聚合物微球。2.根据权利要求1所述的用于生物酶固定化的核壳式超顺磁性聚合物微球的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤 将氯化铁和硫酸亚铁溶于去离子水中，在N2保护下加热至一定温度后用氨水调节体系pH值为10 11，继续熟化I 3h，冷却至室温，用去离子水反复洗涤沉淀至中性，得到超顺磁性的Fe3O4纳米粒子； 将上述Fe3O4纳米粒子分散到由无水乙醇、去离子水和氨水组成的混合溶剂中，超声分散15 45min后加入正硅酸乙酯，在室温下继续反应8 16h后，用去离子水反复洗涤沉淀至中性后于50 80°C真空干燥8 16h，得到超顺磁性的Fe304/Si02纳米粒子； 将上述Fe304/Si02纳米粒子分散到溶解有N，N’ -亚甲基双丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸缩水甘油酯和烯丙基缩水甘油醚等聚合物单体以及偶氮二异丁腈引发剂的甲酰胺溶液中，然后加入到溶解有Span60和TWee...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭杨龙，杨露，卢冠忠，朱小丽，詹望成，王筠松，郭耘，王丽，张志刚，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：
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