本发明专利技术涉及结合Grb7蛋白SH2结构域的非磷酸化配体及其制药用途。具体而言，本发明专利技术涉及一种肽段，具有通式I：GIPT/K/NX15G/WD/IP所示的序列，其中X选自氨基酸残基P、S、T、Q、N、H、A、Y、L、E、D、F、R、K，X15整体富含P、S、T、Q、N，且其中P占21％，T占18％，S占13％，且所述肽段是Grb7蛋白SH2结构域的非磷酸化配体，能够结合Grb7蛋白SH2结构域。本发明专利技术还涉及含有通式I所示肽段的肽段、包含所述肽段的组合物、所述肽段的编码序列、含有所述编码序列的核酸构建物、含有所述编码序列和/或所述核酸构建物的宿主细胞，及其用途，及筛选所述肽段的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及结合Grb7蛋白的SH2结构域的非磷酸化配体及其制药用途。
技术介绍
Grb7蛋白家族最初是由筛选编码磷酸化酪氨酸受体配体的cDNA表达文库而发现的(I，2)，作为接头蛋白，该家族成员通过SH2结构域募集下游信号分子并参与多种信号通路传导途径。该家族蛋白一共有3个成员Grb7、GrblO和Grbl4，其中，Grb7蛋白主要参与细胞的迁移和血管化过程，GrblO蛋白在细胞代谢调节和发育过程中发挥重要作用，而 Grbl4则主要参与调节细胞代谢和细胞增殖过程(3) 蛋白家族的结构上一共有3个主要的功能区域，N末端为富含脯氨酸的序列(2)，其PS/AIPNPFPEL结构域可以结合某些蛋白中的SH3结构域(4)，中间的功能区域称为GM区，该区包括3个功能性的结构域，分别为PH 结构域、RA结构域和BPS结构域(Between PH and SH2),该结构域和线虫Caenorhabditis 的Mig-1O蛋白有着很高的序列同源性(5，6)，C末端为一 SH2结构域。SH2结构域作为接头蛋白、激酶、细胞骨架等结构，在细胞信号传导中发挥重要作用(7)。由于SH2结构域的发现，人们开始由结构域之间的相互作用来研究蛋白-蛋白间的相互作用及细胞的信号通路(8)。SH2结构域由约100个氨基酸残基构成，其二级结构包括一个反平行的β折叠和两个α螺旋(9)，SH2结构域中有一个阳性的结合口袋(10)，通过这个结构，SH2结构域可以直接识别并结合磷酸化酪氨酸模序(11)。不同的SH2结构域在结合各自的磷酸化配体时，有各自不同的偏好(12)。近年来的研究显示，SH2结构域的结合特性远超过目前用计算机软件所预测的结果，因此，在研究SH2结构域的生物活性时，应采取个性化的措施，且应把发生相互作用的SH2/磷酸化配体对的空间构象考虑在内(13)。尽管SH2结构域主要识别磷酸化配体，不过SH2结构域并非只是识别磷酸化配体， 且SH2结构域与磷酸化配体间的结合也并非很牢固(10)。目前已有许多关于SH2结构域识别非磷酸化酪氨酸模序的报道。非磷酸化配体结合SH2结构域的亲和力，大约是磷酸化配体与SH2结构域间亲和力的1/104 IO5 (35)。Grb7蛋白家族的SH2结构域与其它典型的SH2结构域略有不同，首先，在氨基酸的排列上，Grb7蛋白家族的SH2结构域更具扩展性(14)，其次，其它的SH2结构域通常为单体结构，但GrblO Y蛋白SH2结构域和Grb7蛋白SH2结构域却可以形成二聚体结构(15)。 同时，Grb7蛋白家族3个成员之间的SH2结构域也有所不同首先，从氨基酸序列来看， GrblO蛋白和Grbl4蛋白更为相似(I)，其序列重合性约为90%，Grb7蛋白的SH2结构域仅有60% 70%的氨基酸是和GrblO蛋白和Grb 14蛋白相似的，其次，只有Grb7蛋白SH2结构域倾向于结合具有β折叠结构的肽段，该特性和Grb2蛋白SH2结构域的结合特性相似(16)。 Grb7蛋白通过其SH2结构域广泛参与各种信号传导途径，如胰岛素的信号传导途径(17)，表皮生长因子受体ErbB2、ErbB3和ErbB4的信号传导途径(18)，黏着斑激酶的信号传导途径(19)，c-Kit/SCFR的信号传导途径(20)等。由于Grb7蛋白的SH2结构域与某些肿瘤的恶性扩增和转移密切相关，如乳腺癌(21)，食管癌(22)，胰腺癌(23)，白血病(24) 等，目前，已有许多将该结构域作为靶点设计的抗肿瘤药物，Krag等人已发现了一种可结合 Grb7蛋白SH2结构域的非磷酸化肽段-G7-18NATE，在体外试验中，该肽段与Grb7蛋白SH2 结构域的亲和力约为磷酸配体ErbB3与Grb7蛋白SH2结构域亲和力的1/10 (25)，且该肽段可有效抑制Grb7蛋白和ErbB3蛋白的结合(26)、抑制胰腺癌的转移(23)和乳腺癌细胞的增殖(27)，可作为化学药物的研发基础(28)。酵母双杂交是一种具有较高灵敏度的检测蛋白相互作用的方法，尤其是能检测到一些不容易被其它方法检测到的蛋白相互作用(8)，根据一篇综述的报道，在酵母双杂交系统里面被检测到的相互作用蛋白间的亲和力是μΜ级别的范围(31)。因此，酵母双杂交技术非常灵敏，能够检测到常规生物化学方法检测不到的、弱的或瞬时的蛋白质相互作用 (29，30)。这是由于细胞内阳性信号经过了多次放大(比如转录、翻译、酶体系的逐级放大)。而且，双杂交反应发生在细胞内，使蛋白能够最大程度的保留其原始信息，这也大大增加了检测的灵敏度和准确性。但是，传统酵母双杂交技术是用于筛选cDNA文库，这会导致由于蛋白表达的丰度差异而使低丰度配体被高丰度配体掩盖；而且一次实验一般只筛选一种组织来源的cDNA文库，不能得到全面的结果。而用酵母双杂交筛选随机多肽文库，则可以同时解决亲和力竞争、丰度抑制和组织差异表达的问题。因此从理论上来说，一次随机多肽文库筛选就可以相对全面地研究目的结构域的结合特性。 识别线形模体的蛋白质相互作用结构域的结合特性可利用随机的或多样性的多肽文库来研究。通过筛选高度复杂的短肽文库，能够全面地研究目的结构域的识别特性。根据得到的识别规律搜索蛋白数据库，可在全蛋白质组水平上预测潜在的天然配体。筛选随机多肽文库还能得到筛选cDNA文库无法得到的非天然配体。这种非天然配体不仅可作为一种模拟工具用于功能研究，而且可能为药物分子的研究提供重要依据。由于Grb7蛋白SH2结构域参与了众多的信号传导途径，和肿瘤的恶性增殖及转移密切相关(33，34)，因此针对Grb7蛋白SH2结构域研发抗Grb7蛋白高表达的肿瘤药物，具有重要的临床意义。比如，最近报道了一类Grb7蛋白SH2结构域的化学拮抗剂，此类拮抗剂是基于计算机辅助的Grb7蛋白SH2结构域配体设计，通过搜索NCI的化学数据库而得到的，且被证实可有效抑制高表达Grb7蛋白的MDA-MB-468乳腺癌细胞系的生长(28)。同时，由于与磷酸化配体比较，非磷酸化配体因不易被体内广泛存在的磷酸酶降解而稳定存在，同时，酵母细胞内无磷酸化修饰，适合筛选蛋白的非磷酸化配体。美国专利号No. 7229960公开了一类非磷酸化肽段及其在体内体外试验中可以特异结合Grb7蛋白的信号传导的实验结果。因此，本专利技术的技术目的在于利用酵母双杂交技术和随机多肽文库筛选Grb7蛋白SH2结构域的非磷酸化配体并探究所述非磷酸化配体在制药领域中的用途。
技术实现思路
因此，本专利技术的第一方面涉及一种肽段，其具有通式1:gipt/k/nx15g/wd/ip所示的序列，其中X选自氨基酸残基P、S、T、Q、N、H、A、Y、L、E、D、F、R、K，X15整体富含P、S、T、 Q、N，且其中P占21%，T占18%，S占13%，且所述肽段是Grb7蛋白SH2结构域的非磷酸化配体，能够结合Grb7蛋白SH2结构域。优选地，X1选自氨基酸残基H、Y、A或Q，X2选自S、T、P、F、Q 或 D，X3 选自 S、P、T、Q 或 N，X4 选自 P、T、S 或 N，X5 选自 Q、T、P、S、D 或 A，X6 选自 Y、P、S、T 或 A，X7 选自 3、1'3、￥或札父8选自 P、L、N、Q 或 S，X9 选自 P本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肽段，其具有通式I：GIPT/K/NX15G/WD/IP所示的序列，其中X选自氨基酸残基P、S、T、Q、N、H、A、Y、L、E、D、F、R、K，X15整体富含P、S、T、Q、N，且其中P占21％，T占18％，S占13％，且所述肽段是Grb7蛋白SH2结构域的非磷酸化配体，能够结合Grb7蛋白SH2结构域。
【技术特征摘要】
1.一种肽段，其具有通式1:gipt/k/nx15g/wd/ip所示的序列，其中X选自氨基酸残基 、3、1\0、队!1、六、￥、1^3、0、卩、1 、1(，父15整体富含？、5、1\0、1且其中？ ^ 21%, T 占 18%,S占13%，且所述肽段是Grb7蛋白SH2结构域的非磷酸化配体，能够结合Grb7蛋白SH2结构域。2.根据权利要求1或2所述的肽段，其特征在于X1选自氨基酸残基H、Y、A或Q，X2选自 S、T、P、F、Q 或 D，X3 选自 S、P、T、Q 或 N，X4 选自 P、T、S 或 N，X5 选自 Q、T、P、S、D 或 A，X6选自 Y、P、S、T 或 A，X7 选自 S、T、E、Y 或 H，X8 选自 P、L、N、Q 或 S，X9 选自 P、L、A、S、E*T，X1。选自 S、L、N、P 或 Q，Xn 选自 T、P、H 或 S，X12 选自 Y、R、P、S、A、Q 或 H，X13 选自 S、P、H、N、E 或 K，X14 选自 P、L、Q、T 或 N，X15 选自 P、T 或 N。3.根据权利要求1或2所述的肽段，其选自 3 和 52. GIPTHSSPQYSPPSTYSPP⑶P(SEQ ID NO.1) 10.GIPNYTPTTPTLLLTRPLPGIP(SEQ ID No. 2) 16.GlPTATTSPYENANPPHQTffDP(SEQ ID No. 3) 41-A.GIPTQPTTSSEPSPPSNPPWDP(SEQ ID No. 4) 41-BGIPTHHQNDTYNSPHAHPNRDP(SEQ ID No. 5) 60.RNSYFTFLPARSLYLIKTHWDP(SEQ ID No. 6) 67.GIPKAQNTTATPEQHASPTGIP(SEQ ID No. 7) 98.GIPNQDPPAATQSPSQETTWDP(SEQ ID No. 8) 106.GIPTSTPNTHSTTSHHKNPWDP(SEQ ID No. 9)。4.一种含有根据权利要求1至3任一项所述肽段的肽段，其具有通式II =BhGIPiyK/NXuG/WD/IPZh，其中u为不大于5的数值，优选地，u为3，优选地，B1为V，B2为A，B3为V，j为不大于5的数值，优选地，j为3，优选地，Z1为...
【专利技术属性】
技术研发人员：高友鹤，张丹，胡斯奇，马素参，
申请(专利权)人：中国医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：
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